[发明专利]方法

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质的合成和修饰。具体地，本发明涉及赖氨酸连接的蛋白质的修饰。

背景技术

赖氨酸残基是蛋白质翻译后修饰的关键决定因素，它们在主要的翻译后修饰如泛素化、甲基化和乙酰化中的作用已为人熟知。然而，选择性地修饰蛋白质中的特定赖氨酸残基仍是一个问题。

泛素化是一个可逆的翻译后修饰，在该过程中受体蛋白中的特定赖氨酸残基与泛素供体的C-末端形成异肽键。虽然泛素化通过蛋白酶体靶向来调节蛋白质稳定性的作用是公认的，但目前显示泛素参与生物学的几乎每一个方面，包括细胞信号转导、细胞内转运和对DNA损伤的应答^1,2。泛素通过它的每个赖氨酸残基(K6、K11、K27、K29、K33、K48或K63)或通过N-末端形成共价链，并且认为泛素在不同的生物过程中介导的不同功能可能被编码在不同泛素链的不同性质中^2，3。

虽然蛋白质组学研究揭示体内存在所有的链类型^4，5，但所知的多数均与K48链和K63链有关，这两个链分别在蛋白酶体降解和细胞信号传导中起重要作用^1，6。相比之下，对其他所谓的“非典型”连接(linkage)知之甚少，而这些“非典型”连接则占在蛋白质组学数据已知的模式生物中发现的泛素连接的一半以上⁵。研究具体泛素链的作用的关键难题在于合成具有所定义的连接的均质链。

本发明旨在克服与现有技术相关的问题。

发明概述

本发明人已经解决了特异靶向多肽链内用于修饰的单个赖氨酸残基的问题，其中一方面是在基因工程上编码用于目标赖氨酸的化学保护。这能够实现多肽链内特定残基的位点特异性保护。

更重要的是，本发明人开发了用于差异保护多肽中的赖氨酸的技术。具体而言，本发明人教导了不同于基因工程编码的保护的化学保护的使用。

通过这种方式，产生的多肽可具有受通过目标赖氨酸的基因工程编码保护的位点特异性保护的所述目标赖氨酸。然后，这种具有受位点特异性保护的赖氨酸的多肽可以进行化学处理以保护每个剩余的(未被保护的)具有不同化学保护基团的赖氨酸残基。这种双重方法具有的优点是形成的多肽在其赖氨酸上具有两种不同类型的化学保护。这能够使原始的目标赖氨酸通过化学被选择性地去保护，同时使其他赖氨酸上的其他保护基团保持完整。通过这种方式，目标赖氨酸被位点特异地的去保护并因此可以被修饰，而其他赖氨酸则不受影响。

最后，根据需要所有未被修饰的赖氨酸都可以被任选地去保护以留下与天然相同的赖氨酸残基。

本发明是基于选择性的保护/去保护多肽序列中的目标赖氨酸的创造性的差异化学方法。

因此，一方面，本发明提供了修饰包含至少两个赖氨酸残基的多肽中的特定赖氨酸残基的方法，所述方法包括：

(a)提供包含受第一保护基团保护的目标赖氨酸残基和至少一个另外的赖氨酸残基的多肽；

(b)处理所述多肽以保护所述另外的赖氨酸残基，其中所述另外的赖氨酸残基的保护基团不同于所述目标赖氨酸残基的保护基团；

(c)选择性地去保护目标赖氨酸残基；和

(d)修饰(c)的所述去保护了的赖氨酸残基。

合适地，所述多肽的产生包括：

(i)提供编码所述多肽的核酸，所述核酸包含编码所述目标赖氨酸的正交密码子；

(ii)在正交tRNA合成酶/tRNA对存在下翻译所述核酸，其中所述正交tRNA合成酶/tRNA对能够识别所述正交密码子并向所述多肽链中引入受第一保护基团保护的所述目标赖氨酸残基。

合适地，所述正交密码子包括TAG，所述tRNA包括MbtRNA_CUA，所述tRNA合成酶包括MbPylRS。

合适地，由第一保护基团保护的所述目标赖氨酸残基选自由Nε-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸组成的组。

合适地，由第一保护基团保护的所述目标赖氨酸残基是Nε-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸。

合适地，所述另外的赖氨酸残基的保护基团选自N-(苄氧基羰基氧基)琥珀酰亚胺(Cbz-Osu)。当所述另外的赖氨酸残基的保护基团是N-(苄氧基羰基氧基)琥珀酰亚胺(Cbz-Osu)时，合适地，它在碱性DMSO中提供。

合适地，所述另外的赖氨酸残基的保护基团是N-(苄氧基羰基氧基)琥珀酰亚胺(Cbz-Osu)。

合适地，步骤(b)包括用含N-(苄氧基羰基氧基)琥珀酰亚胺(Cbz-Osu)的碱性DMSO处理所述多肽。