[发明专利]改变细胞分化状态的方法及其组合物

说明书

发明背景

发明领域

本发明一般涉及干细胞，更具体地涉及改变细胞分化状态的方法和组合物，以及由其生成的细胞。

背景信息

在胚胎发育期间，机体组织由三个主要细胞群形成：外胚层、中胚层和内胚层。这些细胞群，也被称为主要的生殖细胞层，通过被称为原肠胚形成的过程形成。在原肠胚形成后，各主要生殖细胞层生成细胞群和组织的特定组。例如，中胚层生成血液细胞、内皮细胞、心肌和骨骼肌和脂肪细胞；内胚层生成肝、胰和肺；以及外胚层生成神经系统、皮肤和肾上腺组织。

人胚胎干（hES）细胞是可分化成多种细胞类型的多潜能细胞。当被注入免疫缺陷型小鼠时，胚胎干细胞形成分化的肿瘤（畸胎瘤）。但是，经体外诱导形成胚状体（EBs）的胚胎干细胞提供胚胎干细胞系的来源，该胚胎干细胞系能够在特定生长条件下分化出具有几种组织的特性的多种细胞类型。已知多种方法用于鼠体细胞和人体细胞程序重排成多潜能干细胞——被称为诱导多潜能干（iPS）细胞。在程序重排后，可开始将iPS细胞分化成特定组织类型。

多种干细胞类型及其后代适于程序重排、分化、去分化和转分化，并且是正常人细胞的重要来源，用于治疗性移植——如肝细胞，和用于药物测试和开发。这样的目标需要足够的细胞分化成适于患者需要或适当的药理学测试的组织类型。与此相关，需要有效和可信赖的改变细胞分化状态的方法，如通过程序重排、分化、去分化和转分化细胞。本文提供了这种方法，能够产生同一分化状态的高度富集的细胞群。

发明概述

本发明基于创新的方法和核酸构建物的原始发现，其用于改变细胞分化状态，如程序重排细胞以生成诱导多潜能干（iPS）细胞，和使多种分化状态下的细胞发生分化、转分化或去分化。

因此，本发明提供使目标或受体细胞程序重排、分化、转分化或去分化成不同细胞类型的细胞或者多潜能或分化程度较低的细胞的方法。本方法包括在使细胞转化成多潜能细胞或相应于内胚层、中胚层或外胚层的细胞系的细胞的培养条件下，将核酸构建物或其表达产物引入细胞和培养物。

在多个方面中，本方法利用编码表达盒（cassette）的核酸构建物，该表达盒包括处于可操作连接中的：i）至少一种蛋白质标记；ii）蛋白质转导结构域；iii）融合结构域；iv）核定位信号；和v）至少一种转录因子。因此，本发明进一步提供核酸构建物。

在一个实施方式中，构建物的转录因子是分化或转分化中涉及的核程序重排因子或转录因子。在多个方面，转录因子由SOX族基因、KLF族基因、MYC族基因、SALL4、OCT4、NANOG、LIN28或其组合如OCT4、SOX2、KLF4、NANOG或c-MYC编码。在相关方面，转录因子由如下基因编码：包括OCT4、NANOG、SOX2、SOX17、HNF4、GATA4、HHEX、CEBPβ、CEBPδ、PRDM16、MYOD1、NKX2.5、MEF2c、MYOCARDIN、RUNX2、PDX、NGN、SALL4或SOX9、或其组合，如Oct4、NANOG、Sox2、Sox9、Sox17、HNF4α2、HNF4α4、HNF4α7、HNF4α8、HNF4γ、GATA4、Hhex、CEBPβ、CEBPδ、PRDM16、MyoD1、NKX2.5、Mef2c、心肌素、Runx2-I、Pdx1、Ngn3、Sall4或Runx2-II。

在多个方面，核酸构建物编码至少一种蛋白质标记，如聚(His)、血细胞凝集素（HA）表位、myc表位、几丁质结合蛋白（CBP）、麦芽糖结合蛋白（MBP）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）、钙调蛋白结合肽、生物素羧基载体蛋白（BCCP）、FLAG八肽、nus、绿色荧光蛋白（GFP）、硫氧还蛋白（TRX）、聚(NANP)、V5、S-蛋白、链霉抗生物素蛋白、SBP、聚(Arg)、DsbA、c-myc-标记、HAT、纤维素结合结构域、softag1、softag3、小泛蛋白样改造剂（SUMO）、泛蛋白（Ub）、或其组合。在一个实施方式中，核酸构建物编码至少两种蛋白质标记，如亲和标记和表位标记。在相关实施方式中，该至少两种蛋白质标记包括聚(His)标记和血细胞凝集素（HA）表位标记。

在多个方面中，核酸构建物编码融合结构域。在一个实施方式中，融合结构域包括流感血凝素融合肽或其片段。

在相关方面，核酸构建物编码蛋白质转导结构域。在一个实施方式中，蛋白质转导结构域包括TAT蛋白、VP22蛋白、果蝇触角足（Antennapedia，Antp）同源异型转录因子、或其片段。