[发明专利]由甘油高产率制备3-羟基丙酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种通过在含有甘油的培养基中培养突变微生物而制备3-羟基丙酸的方法，所述突变微生物通过在具有产生辅酶B12能力且具有能够以甘油作为碳源而产生3-羟基丙酸的能力的微生物中插入或扩增丙二醇利用蛋白编码基因而获得。

背景技术

3-羟基丙酸是一种与乳酸和琥珀酸一起作为生物质衍生的平台化学原料备受关注的物质，可用作制备1,3-丙二醇、丙烯酸、丙烯酰胺、丙二酸或诸如聚羟基丙酸的生物聚合物的原料。因此，开发大量制备3-羟基丙酸的技术非常重要。

已知作为用于制备3-羟基丙酸的化学方法，有：在钯催化剂存在下由1,3-丙二醇制备3-羟基丙酸的方法（US 5321156）；在钯/铂催化剂存在下由3-羟基丙醛制备3-羟基丙酸的方法（US 5831121）；使用离子交换树脂由丙烯酸制备3-羟基丙酸的方法（JP2000-159724）；以及在酸或碱催化剂存在下由环氧化物衍生物制备3-羟基丙酸的方法（KR10-0408806）等。

就生物方法而言，威斯康星大学的Suthers等人报道了一种使用过表达源自肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）的甘油脱水酶基因和源自大肠杆菌（E.coli）或酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）的醛脱氢酶基因的重组大肠杆菌菌株由甘油制备3-羟基丙酸的方法（US 6852517）。最近，Rathnasingh等人报道了一种由甘油制备增加量的3-羟基丙酸的新型重组大肠杆菌菌株（Rathnasingh等人，Biotechnol.Bineng.104:729-39.2009）。

然而，使用重组大肠杆菌由甘油制备3-羟基丙酸的方法的缺点在于，需要向培养基供应昂贵的辅酶腺甙钴胺生素（辅酶B12）以使甘油脱水酶复活。

同时，本发明的发明人等发现当在肺炎克雷伯菌中醛脱氢酶基因高表达时，能够以高产率制备3-羟基丙酸而无需添加辅酶B12。

因此，本发明的发明人等为了开发通过肺炎克雷伯菌由甘油制备增加量的3-羟基丙酸的方法进行了多方面的努力，结果发现当罗伊乳杆菌（Lactobacillus reuteri）的丙二醇利用蛋白编码基因在肺炎克雷伯菌中过表达时，能够以高产率制备3-羟基丙酸，由此实现了本发明。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种由甘油高产率制备3-羟基丙酸的方法。

本发明的另一个目的是提供一种能够由甘油高产率制备3-羟基丙酸的突变微生物。

为了实现上述目的，本发明提供了一种突变微生物，所述突变微生物通过在具有产生辅酶B12能力且具有能够以甘油作为碳源而产生3-羟基丙酸的能力的微生物中插入或扩增丙二醇利用蛋白编码基因而获得。

本发明还提供了一种制备具有产生3-羟基丙酸的高能力的突变微生物的方法，其特征在于，在具有产生辅酶B12能力且具有能够以甘油作为碳源而产生3-羟基丙酸的能力的微生物中插入或扩增丙二醇利用蛋白编码基因。

本发明还提供了一种制备3-羟基丙酸的方法，所述方法包括：(a)在含有甘油的培养基中培养上述突变微生物，由此产生3-羟基丙酸的步骤；和(b)回收所产生的1,3-丙二醇的步骤。

本发明还提供了一种肺炎克雷伯菌突变株，其特征在于，在肺炎克雷伯菌中，缺失甘油脱氢酶基因（DhaD）、转录激活因子基因（DhaR）、1,3-丙二醇氧化还原酶基因（DhaT）以及甘油脱水酶复活因子II基因（DhaBA2），而且引入了1,3-丙二醇氧化还原酶编码基因、醛脱氢酶编码基因以及丙二醇利用蛋白基因。

本发明还提供了一种制备肺炎克雷伯菌突变株的方法，其特征在于，在肺炎克雷伯菌中，使甘油脱氢酶基因（DhaD）、转录激活因子基因（DhaR）、1,3-丙二醇氧化还原酶基因（DhaT）以及甘油脱水酶复活因子II基因（DhaBA2）缺失，而且引入1,3-丙二醇氧化还原酶编码基因、醛脱氢酶编码基因以及丙二醇利用蛋白基因。

本发明还提供了一种制备3-羟基丙酸的方法，所述方法包括：(a)在含有甘油的培养基中培养上述肺炎克雷伯菌突变株，由此产生3-羟基丙酸的步骤；和(b)回收所产生的3-羟基丙酸的步骤。

通过下述具体实施方式和所附权利要求书，本发明的其他特征和实施方式将更加明确。

附图说明

图1是表示重组质粒pVOTLp的构建方法图。

图2是表示重组质粒pVOT的构建方法图。

图3是表示肺炎克雷伯菌AK突变株的构建方法图。