[发明专利]用于高通量筛选的组合序列条形码

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及用于测序方法的样本DNA的制备。更具体地，本发明涉及用于高通量测序的核苷酸序列标识符的用途。

背景技术

对低成本测序的高度需求已带动了高通量测序技术的发展。在这种技术中，平行生产数以百万计的序列。例如，454 Life Sciences，现在Roche Applied Sciences开发出了样本DNA的高通量测序技术，其涉及步骤：使DNA片段化，将接头连接至DNA片段，用包被有引物的珠捕获单一DNA片段，在油中的水滴内部在珠上扩增各DNA片段（乳液PCR（emulsion PCR）），随后各珠装载到皮升的孔中，并用焦磷酸测序对各扩增的DNA片段进行测序。一般情况下，高通量测序技术涉及将接头连接至DNA片段（接头可包括用于捕获的引物结合位点）、DNA片段的扩增和/或测序。因为可以产生大量的序列，来自不同来源的样本往往组合于单次高通量测序运行中。为了从样本池（pool）中追溯各样本的来源，目前的高通量测序应用依赖于核苷酸序列标识符的使用。术语核苷酸序列标识符（NSI，（基于序列的条形码或序列索引是可互换的术语并且具有相同的含义。核苷酸序列标识符是一段特定的核苷酸序列，该序列被用作标识符。核苷酸序列标识符包含在引物结合位点的接头下游，从而当从引物结合位点测序时，标识符序列的核苷酸序列得以确定。将包含不同核苷酸序列标识符的不同接头连接至不同样本，之后可以合并样本。当合并样本的序列被确定时，核苷酸序列标识符随着接头所连接的片段的部分序列被一起测序。因此核苷酸序列标识符的存在或不存在确定池中样本DNA的存在或不存在。随着核苷酸序列标识符被一起测序的内部序列的序列，进一步使得能够将该序列指定到其所来源的特定样本，因为核苷酸序列标识符用来鉴定样本DNA来源。

例如，由Roche开发的高通量测序系统（Genome Sequencer FLX系统）使用多重标识符序列（multiplexed identifier sequence，MID）。MIDs是10-mer序列，其并入接头以便将序列读取指定到单个样本。目前正在使用的有超过100个不同的MIDs（454 Life Science Corp(2009)Technical Bulletin No.005-2009）。相似的核苷酸序列标识符可用于其它测序系统。

例如，Rigola等人PLoS ONE.2009;4(3):e4761和WO 2007/037678中描述了这样的方法，在其中核苷酸序列标识符并入引物5′端。通常，核苷酸序列标识符和靶序列没有显著的互补性。因此，引物在5′端含有包含核苷酸序列标识符的一段以及在3′端含有和靶序列互补的序列。当用引物对（引物包括核苷酸序列标识符）扩增样本时，扩增子将包括核苷酸序列标识符。当随后合并样本，并进行高通量测序方法时，核苷酸序列标识符将用来鉴定所测序的扩增子的来源。因此，通过确定核苷酸序列标识符确定扩增子的来源。同时，已被扩增并随着核苷酸序列标识符一起被测序的内部序列也可以被追溯到其所来源的样本。

在这两种情况下，包括核苷酸序列标识符的接头或引物概念是相同的，即确定使用高通量测序平台从多个DNA样本所产生的序列的样本来源，其中DNA样本在样本制备过程中的某些时刻已被多路化（multiplexed），如被组合或被合并。

发明内容

自推出以来，高通量测序技术能力的能力每两年提高一个数量级。采用高通量测序，使得可以多路化越来越多的样本数，为了鉴定样本来源所需的独特接头或引物的数目也越来越多。尽管使用100个不同引物或接头可能已具有挑战性，当数目增至1000时，这可能会成为瓶颈。因此，需要能够减少所要使用的引物和/或接头的数目，因为这可简化样本制备、可减少工作量、可优化技术性能并能降低成本。本发明使得能够减少所需不同的引物和/或接头的数目。通过使用所谓的“分割条形码（split barcode）”可减少数目。根据本发明的分割条形码是出现在至少两个接头和/或引物上的核苷酸序列标识符。使用例如引物对和/或一对接头制备样本DNA（或样本DNA的组合），对中的各引物或接头含有一个核苷酸序列标识符。产生的扩增子或接头连接的DNA片段包括至少两个核苷酸序列标识符。对于各不同样本，可以使用核苷酸标识符的独特组合。核苷酸序列标识符的组合，也一起表示为分割条形码，用作标识符。

附图说明