[发明专利]产生基因嵌合体的方法

权利要求书

1.一种通过体细胞体内重组来产生基因嵌合体的方法，其包括

c)在单个步骤过程中

(iv)用至少一种基因A转化细胞，所述至少一种基因A与要重组的另外的基因具有小于99.5%的序列同源性，所述要重组的另外的基因为所述细胞基因组的整合部或存在于遗传构建体的构架中，

(v)重组所述基因，

(vi)在靶基因组的整合位点产生所述基因的基因嵌合体，其中所述至少一种基因A在5′端或者3′端具有锚定到所述整合位点的5′或3′端的单个侧翼靶序列，和

d)选择包含所述基因嵌合体的克隆。

2.根据权利要求1所述的方法，其中在所述基因嵌合体中使用选择标记物，并根据所述选择标记物的存在来选择所述克隆。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述另外的基因为所述细胞基因组的一部分。

4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其中用至少一种基因A和至少一种基因B共转化所述细胞，其中所述基因A的所述单个侧翼靶序列锚定到所述靶基因组上的整合位点的5′端，和其中基因B连接到锚定至整合位点3′端的单个侧翼靶序列。

5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其中用至少两种不同的基因A1和A2以及任选的用至少两种不同的基因B1和B2来共转化所述细胞。

6.根据权利要求1至5任一项所述方法，其中共转化至少一种其它基因C，所述至少一种其它基因C具有与基因A和/或所述另外的基因的序列杂交的序列以获得所述其它基因C到所述基因A和/或所述另外的基因的组装。

7.根据权利要求1至6任一项所述的方法，其中所述基因A和/或所述另外的基因编码具有活性的多肽或多肽的一部分。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其中将编码生化途径的多肽的多种基因重组和组装。

9.根据权利要求1至8任一项所述的方法，其中所述细胞为修复缺陷细胞。

10.根据权利要求1至9任一项所述的方法，其中所述细胞为真核细胞，或原核细胞，所述真核细胞优选为真菌、哺乳动物或植物细胞。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述细胞为真菌细胞，所述真菌细胞优选选自由酵母菌属、念珠菌属、克鲁维酵母菌属、汉逊氏酵母菌属、裂殖酵母菌属、耶氏酵母菌属、毕赤酵母菌属和曲霉菌属组成的组。

12.根据权利要求1至11任一项所述的方法，其中所述侧翼靶序列为至少5bp。

13.根据权利要求1至12任一项的所述的方法，其中所述侧翼靶序列与所述整合位点的锚定序列具有30%至99.5%范围内的同源性。

14.根据权利要求1至13任一项所述的方法，其中使用选择标记物，所述选择标记物选自由营养缺陷型标记物、抗生素抗性标记物、荧光标记物、敲入标记物、活化剂/结合结构域标记物和显隐性标记物以及比色标记物组成的组。

15.根据权利要求1至14任一项所述的方法，其中所述基因包含于线性多核苷酸、载体或酵母人工染色体中。

16.根据权利要求1至15任一项所述的方法，其中所述基因为线性多核苷酸，所述线性多核苷酸优选300至20,000bp。

17.根据权利要求1至16任一项所述的方法，其中选择具有基因内基因嵌合体的至少一种克隆。

18.根据权利要求1至17任一项所述的方法，其中选择具有基因组装和至少一种基因内基因嵌合体的至少一种克隆。

19.根据权利要求1至18任一项所述的方法，其中获得至少3至20,000碱基对的基因嵌合体，其优选每700bp具有至少3个交换事件。

20.根据权利要求1至19任一项所述的方法，其中所述基因为非编码序列或者多肽的编码变体，所述多肽选自由酶、抗体或其部分、细胞因子、生长因子、疫苗抗原和肽组成的组。

21.一种基因变体的细胞展示方法，其包括使用根据权利要求1至20任一项所述的方法在细胞中创建基因嵌合体的多样性，和将所述多样性展示到所述细胞的表面上，从而获得嵌合体文库。