[发明专利]产生基因嵌合体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及通过部分同源(homeologous)体内重组来产生基因嵌合体的方法。

背景技术

蛋白质设计的主要目的之一是产生具有新的或改善的性质的蛋白质。将所需的活性赋予到蛋白质或酶的能力在化学和制药工业中具有相当大的实际应用。定向蛋白质进化(directedprotein evolution)作为蛋白质工程中强有力的技术平台已经出现，该技术中，试验性搜索变体文库以寻找具有所需性质的克隆。

定向蛋白质进化利用(harness)自然选择的力量来使具有自然界中未曾发现的所需性质的蛋白质或核酸进化。已将各种技术用于产生蛋白质突变体和变体以及用于选择所需的功能。重组DNA技术使整个通路的单独一种或多种结构基因转移到适当的替代宿主，从而快速增殖和/或产生高水平蛋白质。通过反复地突变和筛选通常获得活性或其它性质累加的改善。定向进化的应用主要存在于研究所和工业实验室中以改善蛋白质稳定性和增强酶和生物体的活性或整体性能，或改变酶底物特异性以及设计新活性。大多数定向进化项目寻求进化使得在农业、医学或工业范围(生物催化)中对人类有用的性质。

由于多数天然和新化合物是通过通路而非通过单个酶来产生的，所以整个代谢通路的进化是特别具有吸引力的概念。代谢通路工程通常需要通路中的所有酶协同操作。新的代谢通路的进化以及生物工艺的增强通常通过重组和筛选或选择的重复循环的工艺以进化单个基因、整个质粒、多基因簇乃至整个基因组来进行。

Shao等人(Nucleic Acids Research 37(2):e16 Epub 2008 Dec12)描述了通过在5′和3′端包含酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中的相邻片段的5′或3′端的序列的两侧(锚定)区域的体内同源重组来以单个步骤组装编码整个生化途径的大型重组DNA或基因组。

Elefanty等人(Proc.Natl.Acad.Sci.95,11897-11902(1998)描述了基因打靶实验以产生突变小鼠，其中已将lacZ报告基因敲入到SCL基因座(locus)中。参考图1显示SCL-lacZ基因打靶策略采用了两种锚定序列，即在各5′和3′端的那些。

可在活细胞内进行定向进化，也称为体内进化，或可以根本不涉及细胞(活体外进化)。体内进化具有选择细胞环境中的性质的优点，当将进化的蛋白质或核酸用于活生物体中时这是有用的。酵母的体内同源重组已广泛地用于基因克隆、质粒构建和文库创建。

文库多样性通过诱变或重组来获得。DNA改组(DNAshuffling)使来自多种基因的有益突变的定向重组。在DNA改组中，DNA序列的群体被随机片段化然后重新组装为全长杂种序列。

为了同源重组的目的，将天然产生的同源基因用作起始多样性的来源。单基因改组文库成员典型地为超过95%的同一性。然而，家族改组(familiy-shuffling)使序列的嵌段互换(blockexchange)，其典型地为超过60%的同一性。功能性序列多样性来自经历自然选择的相关的亲代序列；因此，在给定序列中耐受更大数量的突变而不对结构或功能引入有害作用。

具有多达30%多样性的不同来源的DNA片段的重组描述于WO 1990007576A1中。通过在错配修复缺陷细菌中或在错配修复(MMR)系统暂时失活的细菌中的属间和/或种间重组来在体内产生杂种基因(hybrid genes)。由此，避免了修复受损DNA的那些过程，这些过程对趋异序列(divergent sequence)之间的重组，即部分同源重组的频率具有抑制作用。

MMR基本机理的综述由Kunz等人提供(Cell.Mol.Life Sci.66(2009)1021-1038)。

在MMR缺陷植物中描述了靶向部分同源重组(WO2006/134496A2)。靶向具有多达10%差异的序列的基因座是可能的。

同源重组到细菌以产生多核苷酸文库公开于WO03/095658A1。产生多核苷酸的表达文库，在该文库中利用包括与宿主细胞基因组的区域同源的多核苷酸和两侧序列的非复制线性整合盒(linear integration cassette)，将各多核苷酸通过同源重组整合到感受态细菌宿主细胞的基因组中。