[发明专利]β-内酰胺酶抗药性的质谱测量

说明书

技术领域

本发明涉及产生β-内酰胺酶的细菌的抗药性的确定，包括超广谱β-内酰胺酶(ESBL)。

现有技术

我们可以快速轻松地对许多微生物类型，特别是细菌和单细胞真菌，进行质谱鉴定：将少量微生物从普通方法培养的菌落或从营养培养基中的菌落转移到质谱样品载板，并在载板中与含有基质的溶液混合，然后在基质辅助激光解吸电离后进行质谱测量。如果在微生物中的蛋白质有足够的浓度，则质谱图可显示特征蛋白质的质量和强度。该质谱图每次可显示微生物中大约40至80种蛋白质的峰值，可通过利用质谱库中成千上万的参照质谱进行相似性分析来确定其身份。这里鉴定一词表示分类学鉴定，例如，科、属和种的确定。许多地方正在进行研究，以便对具有成千上万微生物的参照质谱库进行整理，这些是可靠的且经过法律批准的医用质谱（所谓的已验证的质谱库）。

在许多研究中以及微生物实验室的日常工作中，这种鉴定微生物的方法已被证明非常成功。这种方法十分快速，成本低，而且误差率极低，远低于传统微生物鉴定方法。

这些方法的特殊版本不仅可以用于鉴定微生物种类，而且还经常用于鉴定亚种，有时甚至用于鉴定株系，如果它们与常见且可质谱检测的蛋白质在质量和强度方面存在不同。关于更多详细描述，请参阅专利申请例如DE 10 2009 032 649 A1（T.Maier和M.Kostrzewa,2009,US2011/0012016 A1;GB 2 471 746 A），其不仅提供了该方法的详细说明，而且还提供了更好的品种搜索方法。

微生物的鉴定对于传染病特别是败血症非常关键。重要的一点是其能够非常快速的鉴定病原体的种类，以便立即采取正确的治疗措施。质谱鉴定已在这些方面接受了试验和验证，目前正在逐渐获得临床和微生物实验室的认可。

然而，在医学领域不仅需要快速鉴定，而且还需要检测出对常用抗生素的抗药性。在不知道抗药性的情况下将无法快速控制疾病。因此，不仅有必要进行快速鉴定，而且还有必要快速确定并辨别微生物物种的抗药性。人们已经知道一些微生物物种对特定抗生素几乎具有完全的抗药性，因此在精确鉴定后才确定抗药性毫无意义。然而，大多数情况下，物种会有无抗药性的株系，还会有轻微抗药性，特别是高抗药性的株系，抗药性会随着抗生素种类的不同而不同。因此，确定抗药性的类型和强度非常重要。

似乎显而易见的是，质谱仪不仅可用于分类学鉴定，而且还可用于确定微生物对特定抗生素的抗药性，特别是细菌的抗药性。但是，已证明这一任务非常艰巨。尽管抗药性必须通过新蛋白质或改性蛋白质的存在来表示，但迄今为止还未证明可在质谱仪测量的蛋白质表达谱中直接进行鉴定。毕竟，在微生物的成百上千或甚至成千上万的蛋白质中，质谱图内仅能测量40至80种蛋白质。因此必须间接地确定抗药性。这种抗药性确定的首次尝试在文件DE 10 2006 021 493 B4(V.Govorun和J.Franzen;GB 2 438 066 B;US 2008/0009029 A1)中介绍；但是这种方法迄今为止还未得到认可。该方法主要基于在加入抗生素后因细胞死亡而引起的蛋白质表达谱的变化，亦或基于与抗药性参照微生物的比较而确定的繁殖停止。

抗生素抗药性一词归类了微生物种的特征（这里主要是细菌)，即减弱或完全中和抗生素活性物质的作用。抗药性现在很普遍，在美国，医院内获得的大约70%的传染性细菌都至少对一种抗生素具有抗药性。患者经常会传染那些对若干种抗生素具有抗药性的细菌株系（多抗药性）。所谓的问题细菌是指抗甲氧西林性金黄色葡萄球菌(MRSA)、假单胞菌属、带有超广谱β-内酰胺酶(ESBL)抗药性的大肠杆菌及结核分枝杆菌。由CDC（美国疾病控制与预防中心）所做的评估认为2004年在医院有两百万传染病例，大约有九万人死亡，远远高于因交通事故或家庭或工业事故而导致的死亡人数。

日常使用的抗生素一词通常表示用于治疗细菌传染性疾病的药剂或药物产品。抗生素在医学界取得的巨大成功首先是青霉素。虽然青霉素取得了成功，但也首次出现了抗药性，这促使研究人员去寻找和发现更多的抗生素：链霉素、氯霉素、金霉素、四环素及许多其他抗生素。现在已知的大部分抗生素都源自于自然物质。通俗的讲，青霉素现在是抗生素的代名词。