[发明专利]细胞穿透肽及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及人细胞穿透肽(CPP)的鉴定和功能表征及其用途，尤其是作为转染载体。

背景技术

细胞质膜是阻止细胞摄取非主动输入的大多数分子的有效屏障，因此也妨碍治疗性物质的定向递送。仅小范围具有特定分子量、极性和/或净电荷的分子能够(被动)扩散通过细胞膜。所有其他分子都必须例如通过受体介导的胞吞作用或通过结合ATP的转运分子主动转运。此外，还可以例如利用电穿孔、阳离子脂质/脂质体、显微注射、病毒递送或包封在聚合物中来人为迫使分子穿过细胞膜。但是，这些方法主要用来递送疏水分子。此外，与这些方法相关的显著副作用及它们的适用性主要限于体外用途的事实妨碍了它们成为用于将药物或其他治疗活性剂递送至细胞来预防或治疗医学病症的有效工具。

具体而言，定向递送的需要也已成为基于RNAi(RNA干扰)的药物研发中的主要挑战。这类药剂包含干扰引起疾病或促进疾病的基因表达的小RNA分子(例如siRNA、miRNA或shRNA)。2001年在哺乳动物细胞中证实RNAi(Elbashir，S.M.等(2001)Nature 411，494-498)之后，很快认识到，可以利用此序列特异性转录后基因沉默机制来研发一类新的药剂，该药剂还可以是用于治疗迄今的治疗干预不易接近的疾病的有希望的手段(De Fougerolles，A.等(2007)Nat.Rev.Drug Discov.6，443-453)。

但是，由于RNAi发生在细胞溶胶中，任何基于RNA的药物都必须穿过细胞膜来发挥其疗效。迄今已描述了几种方法来达到此目标，如使用脂质(Schroeder；A.等(2010)J.Intern.Med.267，9-21)、病毒载体(Liu，Y.P.和Berkhout，B.(2009)Curr.Top.Med.Chem.9，1130-1143)和聚阳离子纳米颗粒(Howard，K.A.(2009)Adv.Drug Deliv.Rev.61，710-720)。

用于使分子易位通过细胞膜的另一种方法是使用细胞穿透肽(CPP)(也称为蛋白质转导结构域(PTD)或膜易位序列(MTS)；综述于例如Fonseca，S.B等(2009)Adv.Drug Deliv.Rev.61，953-964；Heitz，F.等(2009)Br.J.Pharmacol.157，195-206中)。

就它们的一级氨基酸序列和它们的结构二者而言，CPP是一组异源肽分子。CPP的突出实例包括HIV-1TAT易位结构域(Green；M.和Loewenstein，P.M.(1988)Cell 55，1179-1188)和来自果蝇属(Drosophila)的触角足(Antennapedia)蛋白质的同源域(Joliot；A.等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.美国88，1864-1868)。确切的易位机制仍有争议。触角足蛋白质的突变研究显示，称为穿透肽(penetratin)或pAntp的16个氨基酸的序列(Derossi，D.等(1994)J.Biol.Chem.269，10444-10450)对膜易位而言是必要且充分。随后，开发了其他蛋白质衍生的CPP，如HIV-1Tat蛋白质的碱性序列(Vives，E.等(1997)J.Biol.Chem.272，16010-16017)。开发的合成肽是两亲性模型肽MAP(Oehlke，J.等(1998)Biochim.Biophys.Acta 1414，127-139)。

已显示反义DNA或肽核酸(PNA)与CPP的偶联在体内发挥希望的作用。但是，对于哪些特征是CPP发挥其易位功能必需的仍有疑问。一般而言，已在不同CPP之间发现了小的序列和/或结构相似性。到目前为止，唯一始终存在的特征是非常高的碱性(带正电荷)氨基酸含量产生净正电荷。因此，假定CPP最初与细胞膜中的脂质或蛋白质(蛋白聚糖)的带负电荷的首基(head group)结合。但是，一旦结合，该肽仍在膜结合区室内侧。进一步的摄取机制仍是广泛争论的问题。已提出，CPP或者“逆行”转运至ER，它们在ER中进入细胞易位装置(Fischer，R.等(2004)J.Biol.Chem.279，12625-12635)，或者它们直接跨膜易位(Rothbard，J.B.等(2005)Adv.Drug Deliv.Rev.57，495-504)。取决于内化机制，已知的CPP主要定位在细胞核中，或者在它们内化在小泡中的情况下，主要保留在这些小泡内侧，只有小部分释放进入细胞质。