[发明专利]分离高纯度细胞群体的生理学方法

权利要求书

1.在分化设备中分离源自多能细胞的纯的或富集的分化细胞群体的体外方法，所述方法包括使用激活素A信号和Wnt3a信号分化多能细胞，从而使所述多能细胞经历上皮-至-间充质转换(EMT)以产生具有间充质表型的细胞；允许具有所述间充质表型的细胞迁移通过具有接种有多能细胞的上侧的多孔膜并且进入包括三维胞外基质(ECM)的下侧；和使用激活素A信号和Wnt3a信号允许所述三维ECM中的迁移的细胞分化成高纯度定形内胚层(DE)，以及其中所述高纯度DE以大于90％的纯度分离，其中所述多能细胞不是源自人胚胎，其中所述激活素A和Wnt3a信号模拟细胞在原条内移期间接收的TGF-β和Wnt信号，并且其中所述多孔膜具有从5微米至12微米的任何大小的孔。

2.权利要求1所述的方法，其中细胞迁移包含趋化性迁移或通过所述分化设备的结构性能或组件布置而诱导的迁移。

3.权利要求1所述的方法，其中所述DE用于治疗或研究目的。

4.权利要求3所述的方法，其中所述治疗用途包括糖尿病、视网膜病、心脏病或肝脏疾病治疗。

5.权利要求1所述的方法，其中多能细胞选自胚胎干细胞系、诱导多能干细胞、分离自器官和组织的成体干细胞、分离自脐带血的干细胞、分离自毛囊的干细胞、间充质干细胞，神经元干细胞和癌干细胞。

6.权利要求1所述的方法，其中所述多能细胞是哺乳动物多能细胞。

7.权利要求1所述的方法，其中所述多孔膜包括任一高表面积支架，所述高表面积支架包括由下述组成的一种或多种多孔二维或三维膜或海绵体：聚碳酸酯、聚乙烯、聚四氟乙烯或碳酸钙。

8.权利要求1所述的方法，其中所述多孔膜包括接种有多能细胞的上侧和下侧，所述下侧包括胞外基质，所述胞外基质包括人或非人胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、包含硫酸肝素的蛋白聚糖、硫酸软骨素、硫酸角质素、包含透明质酸的非蛋白聚糖多糖。

9.权利要求1所述的方法，其中所述多孔膜包括接种有多能细胞的上侧，其包括纤维结构；海绵体；网状结构；生长因子的分子，所述生长因子的分子包括TGF家族蛋白、激活素A、各种FGF、各种BMP、HGF、KGF、OSM；或各种类型的粘附活细胞，所述粘附活细胞以二维或三维模式或其组合布置在所述多孔膜上。

10.权利要求9所述的方法，其中所述多孔膜用具有生物学活性的分子涂布在任一侧，所述分子包括下述：刺激/促进细胞分化的分子；刺激/促进细胞成熟的分子；刺激/促进细胞迁移的分子；支持细胞迁移的分子；刺激/促进EMT或MTE的分子；刺激增殖的活性分子；或支持细胞分化阶段/状态的活性分子，或其任意组合。

11.权利要求9所述的方法，其中所述多孔膜具有细胞粘附抑制性能。

12.权利要求1所述的方法，其中所述多孔膜的孔形状包括圆形、椭圆形、长方形、三角形、正方形、裂口/裂缝/狭槽、或其任意组合。

13.权利要求1所述的方法，其中所述分化设备的任何或所有组件是生物可降解的。

14.权利要求1所述的方法，其中所述分化设备浸入细胞培养基或缓冲液。

15.权利要求14所述的方法，其中所述培养基是固定的或经分化设备泵入。

16.权利要求1所述的方法，其中所述多能细胞接种在顶面和/或在底部和/或中间或以其他各种取向接种在所述分化设备上。

17.权利要求1所述的方法，其中所述多能细胞与细胞基质预混合，然后接种在所述分化设备上或其中。

18.权利要求1所述的方法，进一步包括用破坏和/或消化胞外基质的化学试剂和/或酶试剂处理。

19.权利要求1所述的方法，其中在将细胞接种在所述分化设备中和/或其上之前、和/或期间、和/或之后施加分化条件。

20.权利要求1所述的方法，其中所述高纯度DE使用免疫细胞化学和流式细胞术通过OCT4或SOX2表达进行评估。

21.权利要求1所述的方法，其中所述高纯度DE被分离而没有污染OCT4-阳性细胞。