[发明专利]分离高纯度细胞群体的生理学方法

说明书

技术领域

本公开总体上涉及干细胞的领域，并且更具体地涉及分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的方法和设备。

背景技术

人多能干细胞，包括人胚胎干细胞(hESC)、人孤雌生殖干细胞(hpSC)和人诱导多能干细胞(hiPSC)能够无限复制并且分化成所有3个胚层：内胚层、中胚层和外胚层的衍生物。因此，人多能干细胞的分化能力具有很大的希望用于治疗性应用。高纯度治疗性细胞的衍生是再生医学的一个主要目标。hESC源自早期胚胎的胚细胞的内细胞团。相比之下，hpSC和hiPSC二者避免该伦理考虑。第一策划产生的hpSC源自由化学刺激物活化的未受精卵母细胞的胚泡的内细胞团。hpSC，像hESC经历广泛的自我更新并且具有体外和体内的多能分化能力。通过诱导特定基因的“强迫”表达，hiPSC人工源自非多能细胞，典型地成体体细胞。hpSC的产生克服了与hESC相关的伦理障碍，因为hpSC的衍生起源于未受精的卵母细胞。iPSC首先于2006年从小鼠细胞并且于2007年从人细胞中产生。除了伦理考虑，hiPSC也避免植入物抗宿主疾病和免疫排斥问题，因为不像hESCs，它们全部源自患者。

多能干细胞的两个有希望的应用包括细胞置换疗法，用于糖尿病和慢性肝病。高纯度DE的产生是产生治疗上有用DE谱系细胞——包括肝细胞和胰内分泌细胞的关键的第一步。DE在原肠胚期间由外胚层细胞形成，所述外胚层细胞经历上皮-至-间充质转换(EMT)并且内移通过胚胎原条。当由来自环境的分化信号发射时，外胚层的上皮样细胞经历多个形态学和生物化学变化，这使能够它们呈现间充质细胞表型。该表型包括细胞内粘着复合物的破坏和上皮细胞顶端-基底极性的丢失。这些细胞骨架变化允许这些细胞离开上皮并开始迁移。EMT的完成通过间充质细胞迁移离开起始的上皮层发信号。一旦形成，经内移起作用的原条产生中内胚层，其随后分离形成中胚层和内胚层。

使用高水平激活素A和Wnt3a信号以模拟细胞在内移期间原条处接收的信号，在体外DE已经由hESC、hpSC和hiPSC得到。但是，关于指导干细胞向DE的主要分化信号的知识还未翻译为方法以分化高纯化的DE而在培养物中没有未分化细胞污染。为了临床应用，这些残留的未分化细胞是主要的安全性考虑，因为它们可产生畸胎瘤。例如，在注入产自hESC的DE衍生物的未纯化胰脏培养物之后，46只小鼠中的7只发展了畸胎瘤。此外，从分化的第一阶段残留的未分化细胞可能显著减小全分化过程的效率。从hESC得到肝细胞样细胞的最先进方案之一产生估计的18-26%的效率，并且分化的肝细胞的富集需要流式细胞计数步骤(产生其中55%的细胞表达白蛋白的群体)。

数个小组已经解决了分化的DE的细胞纯度的问题，认识到不存在未分化细胞产生的DE的重要性。通过含有高剂量激活素A、骨形态形成蛋白-4(BMP4)、成纤维细胞生长因子-2(FGF2)和PI3K化学抑制剂的确定成分培养基实现最好的结果，但是，多能性标记物比如OCT4和NANOG在最终分化细胞产物中是可检测的。所有之前的研究使用二维(2D)培养系统(塑料平皿上的单层培养物)并且不提供基质以促进中内胚层迁移。二维(2D)培养系统也不能容易地呈现生理学有关的三维(3D)ECM环境，其提供在原肠胚形成期间用于迁移的关键信号和底物。因此，本领域仍需要用于分化和纯化DE的新方法和设备。

发明内容

本公开解决了这些需要并且主要通过提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的新方法和设备解决了这些需要，其通过如下步骤进行：分化干细胞群；并且使分化细胞迁移通过分化设备中的多孔膜以分离纯的或富集的分化细胞群。本公开也提供分化设备，用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群，该设备包括多孔膜；和胞外基质。

基于脊椎动物胚胎发育过程的特征，本公开还提供新方法和设备用于提供高纯度DE，其利用DE祖细胞，例如，hESC、hpSC和hiPSC的迁移能力。所公开的方法和设备使用并入与三维(3D)ECM结合的多孔膜的设备来模拟转变通过原条的胚胎发育过程。已经发现，在膜上未分化的hESC、hpSC或hiPSC的处理导致EMT。一旦处理，响应的细胞获得间充质表型和迁移通过膜中的孔进入三维ECM的能力，在那里这些细胞分化成DE。如使用免疫细胞化学和流式细胞术通过OCT4表达评估的，已经发现得到的DE是高纯化的并且未被未分化细胞污染。