[发明专利]非糖基化重组人G-CSF的长期贮藏

说明书

本发明涉及用于非糖基化重组人G-CSF的长期贮藏的方法。

G-CSF(粒细胞-集落刺激因子)是属于细胞因子家族的天然存在的生长因子。G-CSF在造血过程中起关键作用，并增强嗜中性粒细胞和嗜中性子代细胞的成熟、增殖、分化和存活。G-CSF在临床上主要用于控制肿瘤，尤其用于化疗后嗜中性白细胞减少症的治疗，并且其还用于骨髓移植和传染性疾病的治疗。

天然存在形式的人G-CSF为具有5个半胱氨酸残基的约20kDa的糖蛋白。这些残基中的四个形成对该蛋白活性至关重要的两个分子间二硫键。由于从天然来源仅能获得少量的G-CSF，在药物中主要使用重组形式的G-CSF，尤其是通过在原核宿主中表达蛋白而产生的那些。在原核宿主例如大肠杆菌(E.Coli)中表达的蛋白与天然G-CSF的区别在于它们是非糖基化的。在大肠杆菌中表达的蛋白具有在该宿主生物体中表达所必须的额外的N-末端蛋氨酸残基。

由于该蛋白的高疏水性，非糖基化重组G-CSF较不稳定。该分子易于吸附于贮藏容器、小瓶或注射器等的内表面，并形成二聚体和更高级的聚集体。常规的液体G-CSF制剂还对机械应力、例如运输中振摇而导致的应力敏感，并且对意外的冻融敏感，这也可能会导致更高水平聚集体以及生物活性的损失。而且，G-CSF还会经受化学修饰例如脱酰胺化、氧化、二硫键断裂或蛋白水解。比其它降解途径更迅速发生的脱酰胺化是一个特殊问题，因为G-CSF的谷氨酰胺含量高。总之，这可能导致生物学上可获得的活性G-CSF单体的含量减少，尤其在长期贮藏所述蛋白的情况下。这不仅成本高而且从治疗上是不期望，例如在较长时间内以恒定剂量施用G-CSF的情况。而且，由多聚化或脱酰胺化形成的产物可导致不利的免疫应答。

G-CSF制剂的稳定化是各种专利和非专利文献的主题。

DE-A-3723781描述了磷酸盐缓冲的含水G-CSF制剂，其包含药学上可接受的表面活性剂如聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯，用于与人血清白蛋白和甘露醇联合以稳定活性成分。这些制剂在4℃长期保持稳定。然而，由于其抗原性，源自人类和动物的蛋白和肽可能引起不利的免疫反应。

EP-A-0373679公开了具有2.75-4.0的pH值和低导电性的G-CSF制剂，其可以长期贮藏而不会形成聚集物。如果使用，则在这些制剂中使用少于2mM的少量缓冲剂以避免G-CSF的聚集。

EP-A-1197221公开了pH为5-7的长期稳定的G-CSF制剂，其包含赖氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苏氨酸和天冬酰胺中的一种或多种氨基酸以及一种或多种疏水性氨基酸。加入蛋氨酸以防止G-CSF分子中蛋氨酸残基的氧化。

WO-A-2007/034509公开了包含重组人G-CSF和氨基酸的稳定的水性制剂，所述氨基酸是蛋白中蛋氨酸残基的氧化抑制剂。

WO-A-2005/042024公开了包含G-CSF和酸如乙酸或谷氨酸的药物组合物，其不含表面活性剂。

WO-A-2005/039620公开了在宽pH范围内稳定的琥珀酸盐和酒石酸盐缓冲的组合物。

Herman，A.C.等(“Characterisation，Formulation，and Stability of(Filgrastim)，a Recombinant Human Granulocyte-ColonyStimulating Factor.”(一种重组人粒细胞集落刺激因子-(Filgrastim)的表征、制剂和稳定性)，见：Formulation Characterisation andStability of Protein Drugs，第303-328页，R.Pearlman和Y.J.Wang，编著，Plenum Press，New York，1996)中描述了非糖基化重组G-CSF的稳定组合物，其包含10mM乙酸钠，pH4.0、5％甘露醇和0.004％的聚山梨醇酯80。这类组合物在2-8℃保持稳定24小时以上。据发现，在非格司亭(filgrastim)制剂中用山梨糖醇代替甘露醇可以消除意外冻融期间蛋白对聚集的敏感性。然而，根据生产商的说明，应当避免将其贮藏于冰箱中。

WO-A-2007/099145公开了液体乙酸盐缓冲G-CSF制剂，其包含聚山梨醇酯20和/或聚山梨醇酯80作为表面活性剂且pH值在4.1和4.4之间。

WO-A-2008/122415公开了液体水性谷氨酸盐缓冲G-CSF制剂，具有的pH为3.5-4.8，其在例如冻融时碰到的机械应力的条件下是稳定的。