[发明专利]用于胞内代谢物检测的传感器

说明书

本发明涉及就其野生型而言进行了遗传修饰的细胞、用于鉴定具有提高的特定代谢物胞内浓度的细胞的方法、用于产生就其野生型而言进行了遗传修饰的具有特定代谢物的优化产生的细胞的方法、通过此方法获得的细胞、用于产生代谢物的方法和用于制备混合物的方法。

微生物产生的代谢物具有巨大的经济利益。因此，将诸如L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-甲硫氨酸和L-色氨酸的氨基酸用作食物添加剂，L-谷氨酸用作香料添加剂，L-异亮氨酸和L-酪氨酸用于制药工业，L-精氨酸和L-异亮氨酸用作药物，或L-谷氨酸、L-天冬氨酸和L-苯丙氨酸用作用于合成精细化学药品的起始物质。从工业观点看，相关代谢物的另一实例是酮戊二酸(oxoglutarate)，其用作食品补充剂，或用作精氨酸α-酮戊二酸(alpha-ketoglutarate)的前体，精氨酸α-酮戊二酸促进生长激素和胰岛素的释放。

用于产生这类代谢物的优选方法是利用微生物的生物技术产生。尤其是在氨基酸的产生中，可以直接以此方式获得特定代谢物的生物活性和旋光活性形式，此外，还可以利用简单且便宜的原料。所利用的微生物是例如谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，它的亲缘物种ssp.flavum和ssp.lactofermentum(Liebl等，Int.J System Bacteriol.1991，41：255-260)，以及大肠杆菌(Escherichia coli)及相关细菌。

在通过微生物学途径产生上述代谢物中，通常通过突变来修饰特定代谢物生物合成的调节，使得它们产生该特定代谢物超出其自身的需要，并将该特定代谢物分泌入培养基。因此，例如，WO-A-2005/059139公开了利用遗传修饰的谷氨酸棒杆菌菌株产生L-赖氨酸，其中通过改善经磷酸戊糖代谢途径的代谢来达到增加的L-赖氨酸产生。在WO-A-97/23597中，通过提高将这些氨基酸排出细胞的输出载体的活性来在微生物中达到诸如L-赖氨酸的氨基酸产生的增加。

通常通过搜索以极大量产生代谢物的突变体来获得这类超量产生者。此搜索称为“筛选”。在筛选中，通常利用常规化学或物理诱变剂(例如MNNG或UV)来在起始菌株中诱导随机突变(非定向诱变)，并用常规微生物学方法选择突变体。提供代谢物超量产生者的另一可能性包括通过定向基因过量表达或缺失或避免竞争合成途径来增强特定合成途径。

但是，此处的问题是，尤其是在非定向诱变的情况下，难以在大量细胞中检测哪一个细胞中发生了这样的突变，该突变导致所关注的代谢物的胞内合成增加。这需要的筛选方法非常耗时且昂贵。

本发明基于克服源自现有技术的不足的目的，其与超量产生特定代谢物的遗传修饰细胞的检测相关。

具体而言，本发明基于提供遗传修饰细胞的目的，其中可以在突变后以简单的方式鉴定导致超量产生特定代谢物的那些突变体，且可以可选地将它们从其余细胞分开。

本发明所基于的另一目的由提供用于鉴定具有提高的特定代谢物的胞内浓度的细胞的方法组成，该方法使得可能以极其简单和便宜的方式在大量细胞中或从大量细胞(例如在细胞悬液中或从细胞悬液)鉴定并可选地定向分开这种细胞。

本发明还基于提供具有特定代谢物的优化产生的细胞的目的，其中以定向方式引入或通过定向突变产生已通过上述筛选方法鉴定为对超量产生此代谢物有利的基因或突变。

通过这样的细胞来对达到上述目的作出贡献，该细胞就其野生型而言进行了遗传修饰，且包含编码自发荧光蛋白的基因序列，其中该自发荧光蛋白的表达依赖于特定代谢物的胞内浓度。