[发明专利]核糖核酸内切酶组合物及其使用方法

说明书

交叉引用

该申请要求2010年5月10日提交的美国临时专利申请号61/333,163；2010年7月19日提交的美国临时专利申请号61/365,627；以及2010年11月12日提交的美国临时专利申请号61/413,287的权益，这些申请各自以引用方式全部并入本文。

关于政府赞助研究的声明

该发明是根据美国国立卫生研究院授予的拨款号T32GM07232和美国国家科学基金会授予的拨款号MCB-0950971的政府支持下进行的。政府具有本发明的某些权利。

发明背景

在二十世纪七十年代，DNA限制酶通过使随意裂解特定DNA序列成为可能而改变了分子生物学。目前RNA分子的测序必需将RNA拷贝进DNA链，然后通过常规方法来对所述DNA链进行测序。该方法也称为RNASeq，其有效并且可产生数百万个序列读数。然而，由于个别步骤的序列依赖性功效，产生cDNA的必要性导致固有偏好。

文献

Carte等(2008)Genes Dev.22：3489；美国专利公开号2010/0093026。

发明概要

本公开提供了变体Csy4核糖核酸内切酶、编码变体Csy4核糖核酸内切酶的核酸以及经所述核酸遗传修饰的宿主细胞。也提供了变体Csy4核糖核酸内切酶用于多种应用。本公开也提供了检测靶多核糖核苷酸中特定序列的方法；以及调节真核细胞中靶RNA的生成的方法。

附图简述

图1A-C示出Pal4Csy4对前体-crRNA(pre-crRNA)底物的特异性识别。示出的核苷酸序列是5′-GUUCACUGCCGUAUAGGCAGCUAAGAAA-3′(SEQ ID NO：1)。

图2A-C示出结合RNA底物的Csy4的晶体结构。

图3A和3B示出：Csy4的催化中心的详细视图(图3A)；以及Csy4野生型(WT)和突变体的裂解活性(图3B)。

图4示出12个Csy4序列中不变的氨基酸。Pa(SEQ ID NO：8)；Yp(SEQ ID NO：34)；Ec89(SEQ ID NO：39)；Dn(SEQ ID NO：79)；Ab(SEQ ID NO：84)；MP1(SEQ ID NO：2)；MP01(SEQ ID NO：3)；SW(SEQ ID NO：4)；Pm(SEQ ID NO：85)；Pw(SEQ ID NO：13)；和Dd (SEQ IDNO：10)。

图5A-5BD展示各种Csy4多肽的氨基酸序列比对以及由各Csy4多肽识别的RNA序列的核苷酸序列。

图6示出无酶活性、序列特异性核糖核酸内切酶的氨基酸序列的例子。

图7示出检测靶多核糖核苷酸中特定序列的方法的例子。

图8示出咪唑对各种无酶活性的Csy4变体的活化的作用。

图9示出分离靶RNA的示例性方法。示出Csy4靶茎-环(SEQ ID NO：103)。

图10示出调节真核细胞中靶RNA的表达的示例性方法。示出Csy4RNA底物序列(SEQ ID NO：103)。

定义

如本文所使用，“多核糖核苷酸”是指核苷酸的聚合形式，并且包括RNA、包含脱氧核苷酸的RNA以及包含核苷酸的DNA。在一些情况下，多核糖核苷酸可包括一种或多种修饰的核苷酸(例如，脱氧肌苷、脱氧尿苷或羟甲基脱氧尿苷)。在一些情况下，多核糖核苷酸仅由核苷酸组成(即，不包括任何脱氧核苷酸)。在一些情况下，多核糖核苷酸包含核苷酸，以及一种或多种修饰的核苷酸，但不包括任何脱氧核苷酸。在其他情况下，多核糖核苷酸包含核苷酸，并且可包含一种或多种修饰的核苷酸，以及一种或多种脱氧核苷酸(包括修饰的脱氧核苷酸)。在一些情况下，其中多核糖核苷酸包含一种或多种脱氧核苷酸，脱氧核苷酸占多核糖核苷酸中总核苷酸的约50％至约40％、约40％至约30％、约30％至约20％、约20％至约10％、约10％至约1％或者小于1％。