[发明专利]软骨素的生物技术制备

权利要求书

1.产生软骨素的重组微生物，所述软骨素定义为由经β1-3(GlcUA→GalNAc)键和β1-4(GalNAc→GlcUA)键连接的D-糖醛酸(GlcUA)和N-乙酰-D-半乳糖胺(GalNAc)的交替残基组成的线性糖胺聚糖，其特征在于，在所述微生物中编码负责将果糖残基加至线性软骨素主链的酶的基因被失活。

2.根据权利要求1的产生软骨素的重组微生物，其中编码负责将果糖残基加至线性软骨素主链的蛋白质的原始存在的基因被失活，所述失活通过全部或部分缺失或取代所述基因或者通过插入另外的核苷酸序列的干扰进行。

3.根据权利要求1和2任一项的重组微生物，其中被失活的基因为编码负责将果糖残基加至线性软骨素主链的蛋白质的基因，所述蛋白质选自：

(A)包含SEQ ID N°2的氨基酸序列的蛋白质；

(B)包含经缺失、取代或插入一个或多个氨基酸修饰的SEQ ID N°2的氨基酸序列且具有果糖基转移酶活性的蛋白质；和

(C)包含与SEQ ID N°2的氨基酸序列具有至少50%同源性的氨基酸序列且具有果糖基转移酶活性的蛋白质。

4.根据权利要求1-3任一项的重组微生物，其中被失活的基因为kfoE基因或选自以下的DNA：

(a)包含SEQ ID N°1的核苷酸序列的DNA；

(b)与包含互补于SEQ ID N°1的核苷酸序列的DNA杂交且编码具有果糖基转移酶活性的蛋白质的DNA；和

(c)包含与SEQ ID N°1的核苷酸具有至少50%同源性的核苷酸序列且编码具有果糖基转移酶活性的蛋白质的DNA。

5.根据权利要求3和4任一项的重组微生物，其中所述基因通过全部或部分缺失或取代其核苷酸序列，或者向其核苷酸序列插入一个或多个核苷酸而被失活。

6.根据权利要求5的重组微生物，其中被失活的基因为kfoE基因。

7.根据权利要求6的重组微生物，其中kfoE基因通过以卡那霉素抗性盒对其进行全部或部分取代及其后续去除、得到全部或部分缺失kfoE基因而被失活。

8.根据权利要求1-7任一项的重组微生物，其来自属于选自埃希式菌属、嗜血杆菌属、弯曲杆菌属、粘球藻属和弧菌属的属的细菌。

9.根据权利要求1-8任一项的重组微生物，其中所述微生物来自属于大肠杆菌种的细菌。

10.根据权利要求9的重组微生物，其来自属于2类K抗原的大肠杆菌种的血清型。

11.根据权利要求10的重组微生物，其来自大肠杆菌O5:K4:H4U1-41菌株。

12.根据权利要求1-11任一项的重组微生物，其为大肠杆菌DSM23644。

13.生物技术制备软骨素的方法，其包括以下步骤：

a.在合适的培养基中培养权利要求1－12任一项的重组细菌

b.回收并纯化微生物培养物中存在的软骨素。

14.根据权利要求13的生物技术制备软骨素的方法，其中所述重组微生物为大肠杆菌DSM23644。

15.生物技术制备的软骨素，其可通过权利要求13的方法获得。

16.可通过权利要求13的方法获得的权利要求15的生物技术制备的软骨素，其中所述重组微生物为大肠杆菌DSM23644。