[发明专利]软骨素的生物技术制备

说明书

发明目的

本发明涉及一种产生软骨素的新的重组微生物以及软骨素的生物技术制备方法。

在本发明中，术语软骨素指定义为线性糖胺聚糖的线性多糖，其由通过β1-3(GlcUA→GalNAc)键和β1-4(GalNAc→GlcUA)键连接的D-糖醛酸(GlcUA)和N-乙酰-D-半乳糖胺(GalNAc)的交替残基构成。

发明背景

硫酸软骨素为糖胺聚糖，其中糖醛酸(GlcUA)和N-乙酰-D-半乳糖胺(GalNAc)经β1-3键和β1-4键分别地线性和交替连接，来自在其GalNAc残基中进行不同程度的硫酸化的线性多糖链。

其存在于动物中，在软骨和结缔组织中，在细胞黏着、组织再生、神经延伸等中起到重要作用。

从非动物源制备软骨素是通向非动物来源的硫酸软骨素制备的重要且期望的步骤。

已有的专利文献描述了几种制备非动物来源的软骨素的方法。

此外，已经克隆并测序了来自动物和微生物的几种软骨素合酶基因。

已经提供了使用导入来自多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)的软骨素合酶基因的重组革兰氏阳性芽孢杆菌制备软骨素的方法(US2007/0281342A1)。

另一发明描述了通过将来自大肠杆菌O5:K4:H4(Escherichia coliO5:K4:H4A)的kfoC和kfoA基因导入产生UDP-糖醛酸的细菌中制备软骨素的方法(WO2008/133350)。

另一发明描述了包括大肠杆菌O5:K4:H4软骨素合酶和前体反应的酶体系中的体外软骨素合成(US2009/0263867A1)。

已知大肠杆菌O5:K4:H4能够产生与软骨素具有相同主链结构的荚膜多糖(K4多糖)，果糖残基连接于其上的GlcUA残基(参见，例如N.Volpi，Glycoconj.J.(2008)25:451-457)。因此，K4多糖由重复的三糖单元组成，所述三糖单元包括经β1-3(GlcUA→GalNAc)连接的D-糖醛酸(GlcUA)部分和N-乙酰-D-半乳糖胺(GalNAc)部分以及结合于所述GlcUA残基的C3-羟基的果糖残基。因此，果糖残基构成所得线性多糖的分支。

通过酸性条件中的水解处理已经实现果糖残基的去除(N.Volpi，Electrophoresis25，692-696(2004))。

尽管已经广泛研究了大肠杆菌O5:K4:H4荚膜抗原基因簇以及产生组成K4线性多糖的糖的代谢途径，迄今为止，还没有发现负责将果糖部分加至线性多糖得到K4多糖的糖基转移酶活性。

本发明的新特征为通过失活基因获得的重组微生物直接制备高分子量软骨素，所述基因编码负责将果糖残基加至软骨素主链的酶，从而消除了将K4多糖进行结合于GlcUA部分的果糖残基的水解去除来获得软骨素的需要。

发明详述

本发明的目的为提供产生软骨素的重组微生物，所述软骨素定义为分别由通过β1-3键和β1-4键连接的D-糖醛酸(GlcUA)和N-乙酰-D-半乳糖胺(GalNAc)的交替残基组成的线性糖胺聚糖，其特征在于，在所述微生物中编码负责将果糖残基加至软骨素主链的酶的基因被失活。

因此，根据本发明的一个方面，提供一种产生软骨素的重组微生物，其特征在于，所述微生物通过将原始存在于其中的基因进行失活而获得，所述基因编码负责将果糖残基加至线性软骨素主链的蛋白质，所述失活包括全部或部分缺失或取代所述基因或通过插入另外的核苷酸序列进行干扰。

根据本发明的一个优选方面，通过失活编码具有果糖基转移酶活性的蛋白质的基因获得的本发明的重组微生物来自属于大肠杆菌种的细菌、优选地属于包括公知的血清型如K1、K5、K7、K12的2类K抗原。