[发明专利]用于生产水解纤维素和/或水解半纤维素的酶的改进方法

说明书

发明领域

本发明涉及用于生产水解木质纤维素生物量的酶的方法。

现有技术

生物乙醇产能的增加及其在生物燃料中的质量是目前的“热门话题”。采用目标在欧盟范围内的讨论下，基于到2020年20％使用可再生能源的最初提议，其中采用10％的生物燃料，这服从于可持续性标准，该标准应当实现从木质纤维素生物量生产的第二代生物燃料。

木质纤维素生物量的特征在于由三种主要的聚合物：纤维素、半纤维素和木质素构成的复杂结构。

以往，生物量转化成乙醇的过程包括多个步骤。预处理可以产生纤维素和可能的半纤维素，它们是酶水解的目标，可以接近酶。预处理的目的是，为了改进木质素和半纤维素的基质中受困的纤维素的可达性而修饰木质纤维素材料的物理和物理-化学特性。可以使用水解纤维素和/或水解半纤维素的酶利用酶水解步骤将纤维素和半纤维素转化为糖。

通过木质纤维素生物量的水解获得的糖是戊糖(主要为木糖和阿拉伯糖)、二糖(纤维二糖)和葡萄糖，其可以被微生物发酵。例如，在醇发酵步骤过程中酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)可以很容易地将葡萄糖转化为乙醇。

最后，蒸馏步骤可以分开并回收从发酵必须物质发酵获得的产物，即，在上述情况下的乙醇。

各种技术-经济研究已经证明，为了使产生的乙醇的成本值接近于从淀粉获得的乙醇的成本值，有必要降低与酶水解步骤相关的成本。

目前，主要通过丝状真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)生产工业的纤维素酶，因为它具有高纤维素酶分泌的能力。

降低成本的办法之一包括优化纤维素酶生产过程的操作条件，以增加其生产率，或者获得具有改进的比活性的酶鸡尾酒。

在诱导基质存在的情况下，里氏木霉的野生型菌株能够分泌很好地适合于纤维素水解的酶复合物。酶复合物的酶包含三种主要类型的活性：内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和纤维二糖酶。其他蛋白，如木聚糖酶，其对于木质纤维素生物量的水解是必要的，也由里氏木霉产生。诱导基质的存在对于水解纤维素和/或水解半纤维素的酶的表达是必不可少的。

已经详细研究了各种碳源队纤维素酶的基因的调节。葡萄糖对纤维素酶生产发挥代谢阻遏作用。这在纤维素，其水解产物如纤维二糖或某些寡糖，尤其是二糖如乳糖或槐糖存在的情况下被诱导(Ilmén等.1997, Appl.Environ. Microbiol. Vol 63, p1298-1306)。碳质基质的性质对酶复合物的组成具有主要影响。因此，可以使用与碳质诱导基质如纤维素或乳糖相关的木糖来显著改善“木聚糖酶活性”(当它以0.5至1mM程度的限制性浓度存在时)(Mach-Aigner等, 2010 Applied and Environmental Microbiology, Vol 76 N°6, p1770-1776)。用木聚糖酶溶解残留的半纤维素(木聚糖)可以促进酶水解(Vàrnai等, 2010 Enzyme and Microbial Technology Vol 46 p185–193)。

为了获得良好的酶生产率，有必要提供可以被快速吸收以允许里氏木霉快速生长的碳源，以及可以允许纤维素酶表达并分泌到介质中的诱导基质。纤维素可以起双重作用。然而，它在工业规模上难以使用，它已经被也作为诱导基质起作用的可溶性碳源如乳糖所替代。

也已经描述了作为诱导物的其他糖如纤维二糖或槐糖(Ilmen等.(1997), Foreman等.(2003) Biol Chem 278, p31988-31997, Pakula等.(2005) Microbiology, 151, p135-143)，但是太昂贵不能在工业规模上使用。

通常，已经观察到，因为在高浓度很容易被吸收的糖的阻遏作用，里氏木霉使用可溶性基质的纤维素酶的产量远低于以分批模式(即在密封的介质中)基于纤维素所获得的。

以本申请人的名义的专利FR-B-2 555 603提出，连续供给碳质基质，以便通过限制培养物中的残留浓度而解除代谢阻遏，并通过优化糖类的数量，以便获得更好的产量和更好的酶生产率。本专利中所述的方法提出使用可溶性糖类(任选地混合物的形式)作为碳源来开始提供基质。然而，与乳糖或与另一种纤维素酶的诱导剂(槐糖，纤维二糖，等)无关的葡萄糖或木糖的连续供给限制不能用来获得高酶生产率。

在工业的纤维素酶生产过程中，乳糖仍然是最合适的基质之一。除了价高，其价格波动很大，占酶的成本价的约三分之一。