[发明专利]稳定的因子VIII变体

说明书

发明领域

本发明涉及修饰的凝血因子。具体地说，本发明涉及与半衰期延长部分缀合的稳定的因子VIII分子。本发明还涉及这类分子的用途。

发明背景

A型血友病是因凝血因子VIII (FVIII)活性缺乏或功能障碍所引起的一种遗传性出血性疾病。临床表现不在于最初的止血，即血块形成正常发生，而是血块因后继凝血酶形成不足而不稳定。通过静脉内注射从血液中分离的或重组产生的凝血因子FVIII来治疗该病。目前的治疗建议从传统的按需治疗转向预防。与冯维勒布兰德因子(von Willebrandt Factor)结合的内源FVIII的循环半衰期是12-14小时，因此预防性治疗应一周进行数次，以使患者获得几乎无症状的生活。对于许多人，尤其是儿童和年轻人而言，IV给药伴随明显的不便和/或疼痛。

在具有显著延长的循环半衰期的因子VIII变体的开发中已经采用了多种方法。很多这类方法都涉及将因子VIII与亲水聚合物例如PEG (聚乙二醇)缀合在一起。WO03031464公开了酶促方法，其中PEG基团可与存在于多肽上的聚糖连接。Blood-2009-11-254755公开了PEG基团可与之特异性缀合的表面暴露的Cys残基的引入。

从WO02103024得知FVIII分子的二硫键的引入。然而，包含二硫键的这类FVIII变体却的确不引起体内循环半衰期延长。

因此本领域需要具有因子VIII活性和显著延长的体内循环半衰期的FVIII变体。

发明概述

本发明涉及具有FVIII活性的重组FVIII变体，其中FVIII变体与半衰期延长部分缀合，且其中在FVIII变体中引入氨基酸变化，以提高变体的体外稳定性。本发明还涉及这类分子在治疗中的用途。与wt因子VIII相比，本发明的分子具有显著延长的体内循环半衰期。

附图简述

图1. 在不同浓度的野生型FVIII和变体中获得的凝血酶活性的最高水平。数据是得自5个独立实验的数据的平均值和SEM，其每个数据均归一化至由2.7 nM野生型FVIII得到的速率。

发明详述

定义：

冯维勒布兰德因子(vWF)：vWF是存在于血浆中并在内皮(在怀布尔-帕拉德体中)、巨核细胞(血小板α-颗粒)和内皮下结缔组织中组成型产生的一种大的单聚/多聚糖蛋白。其主要功能是与其它蛋白质、特别是与因子VIII结合，并且它对血小板粘附于受伤部位是重要的。因子VIII与vWF结合的同时在循环中失活；因子VIII当未与vWF结合时快速降解或被清除。由此断定，降低或消除FVIII的vWF结合能力可被认为是在获取具有延长的循环半衰期的因子FVIII变体中极不理想的方法。然而如果该分子与半衰期延长部分缀合，则可能通过位点定向诱变降低或消除vWF。因子VIII中负责与vWF结合的区域是如EP0319315中公开的跨越残基1670-1684的区域。预期涉及该区域的因子VIII点突变体和/或缺失突变体可改变与vWF结合的能力。本发明特别优选的点突变的实例包括包含一个或多个下列点突变的变体：Y1680F、Y1680R、Y1680N、E1682T和Y1680C。

因子VIII分子：FVIII/因子VIII是主要由肝细胞产生的一种大而复杂糖蛋白。FVIII由2351个氨基酸组成，包括信号肽，并含有由同源性限定的若干不同结构域。有3个A结构域、1个独特的B结构域和2个C结构域。结构域的顺序可列为NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOH。FVIII在血浆内作为在B-A3边界处被分隔的2条链而循环。这两条链通过二价金属离子结合而连接。A1-A2-B链称为重链(HC)，而A3-C1-C2称为轻链(LC)。本文所用“因子VIII”或“FVIII”是指作为内在凝血途径的成员并对凝血是至关重要的人血浆糖蛋白。“天然FVIII”是如SEQ ID NO. 1 (氨基酸1-2332)所示的全长人FVIII分子。B结构域跨越SEQ ID NO 1中的氨基酸741-1648。

 SEQ ID NO 1(wt人FVIII)：

本发明的FVIII分子/变体可以是B结构域截短的因子FVIII分子，其中剩余结构域紧密(closely)对应于SEQ ID NO. 1中氨基酸编号1-740和1649-2332所示的序列。