[发明专利]具有改善的稳定性的基于纤连蛋白的支架蛋白质

说明书

相关申请

本申请要求2010年5月26日提交的美国临时申请61/348,647和2010年5月26日提交的美国临时申请61/348,663的权益，本文通过提述并入其全部内容。

介绍

基于纤连蛋白的支架(fibronectin-based scaffolds)是一类能够进化从而结合任何感兴趣的化合物的蛋白质。这些蛋白质一般利用衍生自III型纤连蛋白(Fn3)或Fn3样域，以天然的或工程化抗体(即多克隆、单克隆或单链抗体)特征性的方式发挥功能，并且具有结构上的优势。具体地说，这些抗体模拟物的结构已经被设计以实现最优的折叠、稳定性和溶解性，即使在通常会在抗体中导致结构和功能丧失的条件下也是如此。基于纤连蛋白的支架蛋白的一个例子是Adnecins^TM(Adnexus，Bristol-Myers Squibb的全资子公司)。

纤连蛋白(fibronectin)是一种在胞外基质的形成以及细胞-细胞相互作用中扮演关键角色的大蛋白；它由三种类型(I、II和III型)的小结构域的多个重复组成(Baron et al.,1991)。Fn3本身是一个大亚家族的范式，该家族包括细胞粘附分子、细胞表面激素和细胞因子受体、分子伴侣、以及糖类结合域等的部分。综述可见Bork&Doolittle,Proc Natl Acad Sci U S A.1992 Oct1;89(19):8990-4;Bork et al.,J Mol Biol.1994Sep30;242(4):309-20;Campbell&Spitzfaden,Structure.1994May15;2(5):333-7;Harpez&Chothia,J Mol Biol.1994May13;238(4):528-39)。

纤连蛋白III型(Fn3)域包括，以从N端到C端的顺序：β或β样链A；环AB；β或β样链B；环BC；β或β样链C；环CD；β或β样链D；环DE；β或β样链E；环EF；β或β样链F；环FG；以及β或β样链G。环AB、BC、CD、DE、EF和FG中的任何和所有可参与结合靶物。BC、DE和FG环都与来自免疫球蛋白的互补决定区(CDR)结构和功能上类似。美国专利7,115,396描述了其中对BC、DE和FG环的改变导致高亲和力的TNFα结合物的Fn3域蛋白。美国申请公开2007/0148126描述了其中对BC、DE和FG环的改变导致高亲和力的VEGFR2结合物的Fn域蛋白。

蛋白质药物可能在其生产、纯化、保存和递送中伴随着物理和化学上的不稳定性。这些不稳定性问题可能对蛋白质治疗剂的生物学性质造成不利的影响，从而降低该蛋白质治疗剂的效力。Sola,2009,J.Pharm Sci,98(4):1223-1245。由此，获得稳定性改善(例如断裂和/或聚集减少)的、能够用于治疗和诊断目的的改良的纤连蛋白域支架蛋白是有利的。

发明概述

本申请的一个方面提供新的基于纤连蛋白的支架蛋白，它们的稳定性增加，包括断裂减少和/或聚集减少。

在一些实施方案中，本文中提供的基于纤连蛋白的支架蛋白包含纤连蛋白III型第10(¹⁰Fn3)域，其中该¹⁰Fn3域包含与SEQ ID NO:1具有至少60%同一性的氨基酸序列，并且以小于100nM的K_D结合靶分子，且其中该¹⁰Fn3域还包含C端尾，所述C端尾不含有DK序列。在示例性的实施方案中，所述C端尾包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述C端尾还包含半胱氨酸残基。在其他实施方案中，所述C端尾包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。

在特定的实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白结合不被野生型¹⁰Fn3域所结合的靶物。在特定的实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白不结合EGFR、人血清白蛋白或PCSK9中的一种或多种。在特定的实施方案中，包含单一¹⁰Fn3域的基于纤连蛋白的支架蛋白不结合EGFR、人血清白蛋白或PCSK9中的一种或多种。在特定的实施方案中，多价的基于纤连蛋白的支架蛋白不结合一种或多种下列的靶分子组合：i)EGFR和IGF-IR；ii)EGFR和任何其他靶蛋白；或iii)人血清白蛋白或及任何其他靶蛋白。