[发明专利]无血培养的脓毒血症质谱诊断

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于快速检测和快速质谱鉴定血液(脓毒血症)或其它体液中感染性微生物的方法和装置。

早先的技术

微生物“鉴定”指的是采用分类体系进行分类：域(真核生物、原核生物和古细菌)、界(植物、动物、真菌)、门、纲、目、科、属、种和亚种。鉴定一份微生物样本指的是，至少确定到属，一般确定到种，如有可能的话，也可以确定到亚种，例如当不同亚种具有不同病原性时，这一点很重要。在更为普遍的意义上，鉴定也意味着确定微生物的其他更多的个体特性，如微生物对抗生素的抵抗性。

许多种属的微生物，特别是细菌、原生动物、微藻和未分化的真菌细胞，如酵母，均可采用质谱方法进行鉴定，确定度很高，可通过将通常方式下在营养培养基上生长的克隆中的少量微生物转移至质谱样品支撑盘上，通过样本制备崩解微生物。从这一样本中获得的质谱图尤其能够显示不同的可溶性蛋白质的质量和丰度；这些蛋白质以足够高的浓度存在于微生物中。通过与参比图库中的参比图谱进行类似度分析，基于该质谱图能够鉴定该微生物。

微生物鉴定对于感染性疾病而言尤为重要，特别是脓毒血症。在脓毒血症中，微生物从一个(通常隐蔽的)来源中持续或间断性地释放入体液中，大多数进入血液循环，以及椎管中。在脓毒血症的情形下，特别重要的是，能够快速检测并鉴定病原类型从而立即给予适当的治疗。目前情况值得警惕：在德国每年有超过60,000人死于脓毒血症；其已成为第三大常见死因。在美国，根据疾病预防控制中心(CDC)的估算，每年约有230,000人死于脓毒血症。近年来，脓毒血症病例数持续增长，每年增长约1.5％。死亡率超过40％。快速鉴定可增加生存率。

在当今全球使用的传统质谱鉴定方法中，首先要培养微生物长成菌落。通常皮氏培养皿中用于培养的营养培养基为琼脂，其可获得“单菌落”，培养时间以小时、天或周计算，这取决于微生物的活力。如果添加或混合菌落，则可通过第二次培养获得单菌落。用小棉棒将所选菌落转移到质谱仪样品支撑盘上，并用基质(通常为α-氰基-4-羟基肉桂酸[HCCA]或2，5-二羟基苯甲酸[DHB])的强酸溶液喷洒，以便借由基质辅助激光解吸(MALDI)将其电离，从而使得微生物崩解。酸(通常为甲酸或三氟乙酸)可以攻击细胞壁，并且基质溶液的有机溶剂(通常为乙腈)能够渗入微生物的细胞内并使变弱的细胞壁破裂。接下来通过蒸发溶剂干燥样品，同时会引起溶解的基质结晶。微生物中的可溶性蛋白以及细胞内的一些其它物质会在这一过程中掺入基质结晶中。

掺入分析物分子的基质结晶可在质谱仪中用聚焦紫外激光脉冲轰击，生成蒸汽等离子体形式的分析物分子的离子，而这些离子可在质谱仪中根据离子质量分离进行测量。基于这一目的，通常采用飞行时间质谱。该质谱记录这些分析物离子，其主要为蛋白质离子。对于鉴定具有最有价值信息的离子的质量约为3,000至15,000原子质量单位。在本方法中，蛋白离子绝大部分是单电荷(电荷数z＝1)，因此只需要提及离子的质量m，而不需总是使用“质量电荷比”m/z(而在使用其他类型的质谱仪时这是必须且约定俗成的)。

可溶性蛋白质离子图谱，例如质谱，非常能反映所关心的微生物种属的特性，这是因为每一种微生物可产生自身的基因决定的蛋白质混合物，每种蛋白质具有特定质量。较高浓度的可溶性蛋白质的丰度可通过质谱技术检测，同样很大程度上由基因决定，仅少部分取决于营养状况或菌落成熟度。蛋白质图谱可用于微生物种属的定性，正如人类的指纹鉴定一样。目前许多公共和私人研究所正在采集可靠的参比质谱图供参比图库使用，这样就可用于医学诊断目的。不过所有的诊断方法需要根据相应国家法律由官方机构批准。在经验证的仪器上的使用经验证的图库的质谱鉴定方法已在数个州市获批。

这一质谱鉴定法已被证明非常成功。其准确鉴定的可靠性远高于目前为止所用的微生物鉴定法。目前已证实，对于上百种不同种属的微生物，鉴定确定度可超过95％。存在疑虑的情况下，如果与目前微生物鉴定方法存在偏倚，则在大多数情况下基因测序可确证质谱鉴定是正确的。由于微生物种属间的关系也可通过质谱图的相似度进行鉴定，所以甚至可能在简单的质谱鉴定的帮助下校正分类体系中微生物种属的分类，最终需要通过更为复杂的DNA测序证实。