[发明专利]自激淋巴球培养用培养基合成物及利用此的自激淋巴球培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及培养恶性肿瘤治疗用自激淋巴球的培养基合成物及利用此的自激淋巴球培养方法，尤其涉及一种在培养基内添加白细胞介素2（IL-2）、白细胞介素12（IL-12）及白细胞介素18（IL-18）外还添加CD3及CD16抗体，有效地增加、活化NK（自然杀手）细胞、T细胞及NKT细胞，并显著提高NK细胞在淋巴球细胞中所占比例，可培养治疗各种恶性肿瘤疗效出色的免疫细胞的自激淋巴球培养用培养基合成物及利用此的自激淋巴球培养方法。

背景技术

最近抗癌治疗中，作为可代替原有手术或放射线疗法、化疗的过继免疫疗法(adoptive immunotherapy)受到人们的瞩目。

过继免疫疗法(adoptive immunotherapy)是从患者的血液萃取自然杀手(Natural Killer：NK)细胞、树突状细胞（DC）、B细胞、T细胞等对于抗癌治疗最重要的免疫细胞后，利用各种刺激剂，培养成抗癌作用非常强的免疫细胞后，重新注入到患者体内的方法。该方法由于使用患者本人的血液，与原先的化疗等相比，副作用小，实施方法也简便，最近被广泛研究。

过继免疫疗法中活化的各种免疫细胞中，NK细胞是淋巴球的一种，对感染的病毒、肿瘤细胞的消灭能力出色，而且不会杀死大部分正常细胞。据研究，这种NK细胞对初期生物体防御机制和人体肿瘤免疫起重要作用。即，NK细胞即便没有由主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex:MHC)表达带来的免疫获得过程，也能杀伤某些自身组织细胞、同种细胞、甚至异种癌细胞，特别对Class1MHC表达少或不表达的目标细胞的杀伤力大。因此，NK细胞可有效杀伤不表达MHC的大部分癌细胞，之外还能杀伤一些被病毒感染的细胞和伤寒沙门氏菌(salmonella typhi)等细菌。

但是，对癌细胞具有出色杀伤功能的NK细胞，在正常人的体内只有末梢血淋巴球的5～15%，特别对癌症患者来说，该比例降低到1%以下，如果不实施过继免疫疗法、提高该细胞的比例，其攻击癌细胞的效率存在很大的局限。

因此，为了通过过继免疫疗法治疗癌症，需要根据患者的癌症病情，大量培养、活化诸如NK细胞在内的各种免疫细胞，而这需要研究相关培养基。现有技术的适用于过继免疫疗法的免疫细胞培养用培养基，其注重点是大量增加免疫细胞中的T细胞。

这种现有技术的免疫细胞培养用培养基在韩国发明专利第0735081号（发明名称：CD4T细胞活化方法）中有所展示。所述CD4T细胞活化方法从血液等生物学试料分离CD4T细胞后，把分离的CD4T细胞通过添加GM-CSF、IFN-gamma、TNF-alpha、植物血凝素(Lectin)及IL-4的细胞因子的培养基进行培养，在试管内活化CD4T细胞，获得预防或治疗细菌感染疾病的合成物。

但所述CD4T细胞活化方法适用的培养基合成物，只筛选、活化免疫细胞中的与获得性免疫相关的T细胞。因此，把该方法适用于治疗肿瘤时，虽然对事件记住的癌细胞可通过大量活化的T细胞有效攻击、杀伤，但对没有记住的各种癌细胞的杀伤效果有限，治疗恶性肿瘤存在局限性。

为了解决这一问题，本发明的发明人先前申请的专利——韩国公开专利第2008-0053929号（发明名称：自激淋巴球培养方法）中提供了一种从人的末梢血分离淋巴球后，在含白细胞介素2（IL-2）、抗CD3、抗CD16及抗CD56抗体的环境下，对其进行培养，提高淋巴球细胞中的NK细胞比例，均匀地活化NK细胞、T细胞及NKT细胞，有效杀伤多种癌细胞的方法。

图1及图2为通过所述自激淋巴球培养方法获得的活化淋巴球表现型变化图表。其中，H1区域为NK细胞、H4区域为T细胞、H2区域为NKT细胞、H3区域为其他免疫细胞的分布。

对以所述自激淋巴球培养方法培养的活化淋巴球，通过流式细胞分析仪(flowcytometry)，分析表面抗原的结果，如图1、图2所示，在培养前，如图1所示，表面抗原的分布最多的是H4区域，而培养后，如图2所示，表面抗体分布最多的是H1区域。而培养后的淋巴球所含CD16+CD56Positive NK细胞的比例由培养前的12.74%变化到培养后的63.42%，NK细胞的比例有所上升。

通过细胞毒性(cytotoxicity)分析，对培养后的活化淋巴球血癌细胞株杀伤能力进行了检测。其结果，与从普通血液萃取的淋巴球相比，活化淋巴球的细胞毒性增加了6～32倍。