[发明专利]用于在相同反应容器内的细胞裂解和PCR的方法

说明书

发明领域

本发明涉及借助于PCR的DNA分析领域。更具体而言，本发明提供了新方法以便执行从仅少数细胞的材料开始的DNA分析，以及通过实时PCR对所述样品DNA执行的后续直接分析。

发明背景

在过去数十年中，PCR已成为用于DNA分析的“役用马（working horse）”，因为它允许指数扩增核酸。特别地，实时PCR（也称为qPCR）已成为有力工具，因为它允许同时分析扩增过程中的扩增的核酸，或不含中间空档，通过解链曲线分析直接在扩增反应后分析扩增的核酸。

此外，PCR的自动化已取得显著进展，因为qPCR系统目前是可获得的，其允许以微量滴定板形式平行执行96、384或1536个反应。系统也已变得更加用户友好。例如，微量滴定板是商购可得的，其中每个反应容器已包含冷冻干燥形式的执行PCR扩增或PCR扩增和检测所需的化合物，并且客户仅需要在实际反应自身之前加入包含待分析DNA的样品。替代系统由Advalytics（AG 480F）提供，其使得在载玻片上的PCR扩增和检测成为可能。

然而，进一步改善用于PCR分析的作业流程仍是挑战，特别是如果分析仅可以对源于仅小数目细胞的DNA执行。在常规实时PCR中，DNA或RNA首先在耗时步骤中从细胞分离，其可以导致材料的丢失。在收获后，将细胞裂解并且将DNA至少部分从裂解物中纯化，因为若非如此，PCR扩增可能至少被定量地抑制。

在这个背景中，本发明潜在的技术问题是提供改善和可自动化的高流通量方法，其允许进一步简化的DNA分析方案。

发明概述

本发明提供了用于扩增靶核酸的方法，其包括步骤

a）将包含一个或多个活细胞的具有第一体积的液体样品转移到容器内

b）向所述容器中加入具有第二体积的PCR反应缓冲液，其中所述第二体积是所述第一体积至少2x大

c）通过在至少90℃温育至少30秒，裂解所述容器内的所述一个或多个活细胞

d）通过用热稳定的DNA聚合酶的聚合酶链反应来扩增所述靶，而不执行中间纯化步骤

其特征在于步骤a）至d）在相同容器内执行。

优选地，步骤c）花费至少1分钟。

所述容器可以是例如微量滴定板的孔。所述微量滴定板的所述容器可以包含PCR扩增引物的干燥组合物。此外，所述干燥组合物可以包含至少一种标记的杂交探针或双链DNA结合荧光化合物。此外，所述干燥的组合物可以另外包含热稳定的DNA聚合酶和dNTPs。

可替代地，所述容器是毛细管或反应管的条的管。

在本发明方法的一个实施方案中，包含至少一个或多个活细胞的所述液体样品已在步骤a）之前通过细胞分选方法获得。

优选地，步骤a）的所述活细胞的数目与在其中执行步骤d）的聚合酶链反应的液体体积相比较的比率不超过2细胞/μl。

如果靶DNA是单拷贝DNA，那么这也在本发明的范围内。

在另一个方面，本发明提供了包含下述的试剂盒

- 设计为适合热循环仪仪器的多个反应容器

- 包含能够执行PCR的热稳定的DNA聚合酶和dNTPs的PCR反应缓冲液。

所述多个反应容器可以以微量滴定板或反应容器的线性条的形式彼此物理连接。

所述反应容器包含至少一对PCR扩增引物，和任选的至少一种标记的杂交探针或双链DNA结合荧光化合物的干燥组合物。

发明详述

一般来说，本发明提供了允许裂解液体环境中的细胞样品的方法，其随后直接用于通过应用聚合酶链反应的核分析，而无需任何中间纯化步骤或复杂的液体处理程序。更精确而言，本发明提供了用于扩增靶核酸的方法，其包括步骤

a）将包含一个或多个活细胞的具有第一体积的液体样品转移到容器内

b）向所述容器中加入具有第二体积的PCR反应缓冲液，其中所述第二体积是所述第一体积至少2x大

c）通过在至少90℃温育至少30秒，裂解所述容器内的所述一个或多个活细胞

d）通过用热稳定的DNA聚合酶的聚合酶链反应来扩增所述靶核酸，而不执行中间纯化步骤。

根据本发明的一个方面，可能所有步骤a）、b）、c）和d）都在相同反应容器内执行。