[发明专利]生产蛋白质的方法

说明书

发明技术领域

本发明涉及一种通过连续灌流培养悬浮中的细胞培养物生产止血蛋白的方法，所述细胞培养物向所述培养物悬液中表达所述止血蛋白，其中所述细胞培养物流经过滤组件，所述过滤组件通向收获孔，所述过滤组件具有允许止血蛋白得以通过的0.1-2.9μm的筛目大小，其中所述流经该过滤组件的流动为交替式切向流。本发明还涉及通过本发明方法生产的蛋白质。

发明背景

止血蛋白是凝血级联的组分。如果缺乏任何一种止血蛋白，轻则会引发健康并发症（health complications），重则患上危及生命的疾病。止血蛋白缺乏症起初是通过补充动物源性的止血蛋白来治疗的。

典型地，已通过连续灌流发酵法或者反复分批发酵法生产重组止血蛋白。这些发酵方法提供高质量的产物。然而，对于提供在不降低质量标准的情况下产生较高量的产物的方法，仍存在着持续的需求。本发明提供了这样的方法。

发明概述

因此，本发明的第一方面提供了一种通过连续灌流培养悬浮中的细胞培养物生产止血蛋白的方法，所述细胞培养物向所述培养物悬液中表达所述止血蛋白，所述细胞培养物流经过滤组件，所述过滤组件通向收获孔，所述过滤组件具有允许止血蛋白得以通过的0.1-2.9 μm的筛目大小，并且其中所述流经该过滤组件的流动为交替式切向流。包含于所述过滤组件内的筛目的大小允许止血蛋白通过所述过滤组件，但不允许细胞或细胞碎片通过。

与先前使用的方法相比，本发明的第一方面的方法允许在显著更高的滴度下生产高质量的止血蛋白。

此外，从实验室规模发酵（5L左右）到大规模发酵（至少500L）均获得在不损害生长、生产力和产物质量的情况下的更高滴度的优势。本发明使得能够在不损害产物质量的情况下产生数量高达现有技术方法的10倍的所需蛋白。

本发明使得能够对工艺参数实施仔细控制，使得方法能够在某一细胞密度下运行，以便在生物反应器的物理特性内的高浓度下提供高质量产物。

附图说明

图1：在实验室规模和中试工厂规模(大于500L)下关于因子IX的活细胞浓度和存活率，使用用泄放（bleed）进行的ATF。

图2：在用于因子IX的先前方法（“半连续方法”）与ATF方法之间的大规模（大于500L）产量比较(在相对比例尺上)。

图3：实验室规模下关于因子IX细胞系的活细胞浓度和存活率，使用在没有泄放下进行的ATF。

图4：实验室规模下，使用ATF的关于因子VIII的活细胞浓度和存活率。

图5：实验室规模下，使用ATF的关于因子VII的活细胞浓度和存活率。

发明详述

本发明的方法中，止血蛋白优选为因子VII (FVII)、因子VIII (FVIII)或因子IX (FIX)之一。本领域存在数量众多的描述诸如FVII、FVIII或FIX等止血蛋白的生产的文献。细胞系、细胞培养和蛋白生产技术为公知的并描述于如下文献中：例如，关于FVII的US 2006/0166915和WO 2004/000366，关于FVII和FIX的US 2009/0130060和WO 2006/018204，关于FIX的WO 2009/130198和US 4,770999，以及关于FVIII的US 20100120094、WO  97/43436、WO 88/08035、WO 87/04187、WO 90/02175、US 20050227913和EP 1707634。所有这些文献均通过引用结合并描述止血蛋白生产的公知原理，所述生产的方法步骤可依据本发明使用。为了根据本发明重组地生产蛋白，使用在培养时表达该蛋白(在适当条件下)的细胞系。这样的细胞系（含有编码止血蛋白例如FVII、FVIII或FIX的重组核酸）是本领域已知的，例如幼仓鼠肾细胞（BHK）、包括无限增殖化人细胞（如PER.C6细胞）在内的人细胞、大鼠细胞和小鼠细胞。根据本发明，所述细胞培养物优选是中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系的培养物，该细胞系在培养中表达目的止血蛋白。更优选地，所述培养物是CHO-KI细胞系。

所述细胞培养物以悬液存在。可用于所述培养物和目的蛋白重组生产的培养基的例子是公知的。合适的例子可以在包括上述专利文献在内的现有技术和本申请文件的实施例部分中找到。