[发明专利]通过分子计数提高等位基因调用的置信度

权利要求书

1.一种估计多个样品中所测序的起始多核苷酸分子的数量的方法，所述方法包括：

将衔接子附接到多个不同样品中的起始多核苷酸分子，其中每个样品对应的所述衔接子包含：

所述样品特定的单一MID；和

简并碱基区域(DBR)，其包含选自以下的至少一个核苷酸碱基：R、Y、S、W、K、M、B、D、H、V、N及其修饰形式；

将所述多个不同的衔接子附接的样品混合以生成混合样品；

扩增所述混合样品中的所述衔接子附接的多核苷酸；

对多个所述扩增的衔接子附接的多核苷酸测序，其中获得所述多个衔接子附接的多核苷酸的每一个的所述MID、所述DBR和所述多核苷酸至少一部分的序列；以及

确定存在于来自每个样品的所述多个测序衔接子附接的多核苷酸中的不同DBR序列的数量，以确定已在测序步骤中测序的每个样品中的起始多核苷酸的数量。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述衔接子进一步包含测序引物位点。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述衔接子进一步包含以下一者或多者：反射序列和启动子位点。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述DBR包含至少2个核苷酸碱基，其中所述至少2个核苷酸碱基的每一个选自：R、Y、S、W、K、M、B、D、H、V和N。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述DBR包含3至20个核苷酸碱基，其中所述3至10个核苷酸碱基的每一个选自：R、Y、S、W、K、M、B、D、H、V和N。

6.根据权利要求1所述的方法，其中将已在测序步骤中测序的每个样品中的多核苷酸的确定数量用于等位基因调用方法。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述测序步骤包括进行下一代测序过程。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个样品中的每一个为基因组DNA样品。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述多个不同的基因组DNA样品中的每一个源自不同的受试者。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述受试者为人。

11.根据权利要求1所述的方法，而且其中在所述附接步骤前针对感兴趣区域富集所述样品。

12.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括针对感兴趣区域富集所述衔接子附接的多核苷酸。

13.根据权利要求4所述的方法，其中所述衔接子为不对称衔接子，其中第一衔接子结构域存在于所述多核苷酸的第一末端并且第二衔接子区域存在于所述多核苷酸的第二末端，其中所述DBR为包含所述第一衔接子结构域中的所述至少2个核苷酸碱基的一个或多个以及所述第二衔接子结构域中的所述至少2个核苷酸碱基的一个或多个的断裂DBR。

14.根据权利要求1所述的方法，其中将所述衔接子在扩增反应中附接到所述多核苷酸分子，其中所述DBR存在于用于所述扩增反应的合成引物中。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述扩增反应为PCR。

16.根据权利要求14所述的方法，其中所述方法进一步包括确定在所述PCR反应中扩增的起始多核苷酸的数量。

17.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法涉及确定所述样品中所述多核苷酸的遗传异质性。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述样品包含源自肿瘤组织的多核苷酸。

19.根据权利要求17所述的方法，其中所述样品包含源自微生物和/或病毒的多核苷酸。

20.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法涉及确定存在于所述多个不同样品中的所述多核苷酸的遗传异质性。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述多个不同的样品源自肿瘤的不同切片。

22.根据权利要求20所述的方法，其中所述多个不同的样品源自受试者的不同肿瘤。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述多个不同的样品源自在不同时间的受试者。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述受试者存在感染，其中确定一种或多种感染原在不同时间的遗传异质性。