[发明专利]通过分子计数提高等位基因调用的置信度

说明书

发明背景

基因分型是遗传研究中用于对基因组作图以及对与遗传性状（如，遗传疾病）有关的基因进行定位的一项重要技术。受试者的基因分型通常包括基于从受试者DNA获得的测序数据确定一个或多个基因组座位的等位基因。二倍体基因组（例如人基因组）可归类为例如在基因组座位上纯合的或杂合的，具体取决于它们针对该基因座所具有的不同等位基因的数量，其中杂合个体具有针对该基因座的两个不同的等位基因，而纯合个体具有针对该基因座的相同等位基因的两个拷贝。当在需要以高统计置信度将基因型与表型相关联的大群中进行研究时，对样品作出正确的基因分型至关重要。

在通过测序对二倍体基因组进行的基因分型分析中，将特定基因组座位的覆盖度（测序读段(sequencing reads)的数量）用于确定等位基因调用的置信度。然而，当在样品制备过程中引入偏差时，例如，当起始样品的量有限时和/或当将一个或多个扩增反应用于制备测序样品时，等位基因调用的置信度将显著降低。因此，在具有有限量DNA的样品中，由于扩增偏差（例如，仅从很少的或甚至一个多核苷酸分子扩增），可以观察到一条染色体上等位基因的覆盖度高于（即，高测序读段数量）不同染色体上等位基因的覆盖度。在这种情况下，当度量等位基因调用中的置信度时，仅依靠覆盖度可能会有误导。

本发明可基于核酸序列分析用于提高等位基因调用以及其他应用中的置信度，尤其是在大群样品中研究基因型的背景下。

发明概述

本发明的方面包括用于确定个体多核苷酸分子的数量的方法和组合物，该个体多核苷酸分子来源于已在特定序列分析配置或过程中测序的相同原始样品的相同基因组区域。在本发明的这些方面，将简并碱基区域(DBR)附接到随后将进行测序（例如，在进行某些过程步骤后，例如扩增和/或富集步骤后）的起始多核苷酸分子。存在于测序运行中的不同DBR序列的数量可用于确定/估计个体多核苷酸分子的数量，该个体多核苷酸分子来源于已在特定序列分析配置或过程中测序的相同原始样品的相同基因组区域。DBR可用于改善许多不同核酸测序应用的分析。例如，DBR使得能够在基因分型测定法中确定无法单独通过读段数量获得的等位基因调用统计值。

在某些实施方案中，本发明的方面涉及用于确定多个不同样品中所测序的起始多核苷酸分子的数量的方法。在某些实施方案中，该方法包括：(1)将衔接子附接到多个不同样品中的起始多核苷酸分子，其中每个样品的衔接子包含：该样品特定的单一MID；和简并碱基区域(DBR)（例如，具有选自以下的至少一个核苷酸碱基的DBR：R、Y、S、W、K、M、B、D、H、V、N及其修饰形式；(2)将多个不同的衔接子附接的样品混合以生成混合样品；(3)扩增混合样品中的衔接子附接的多核苷酸；(4)对多个扩增的衔接子附接的多核苷酸测序，其中获得该多个衔接子附接的多核苷酸的每一个的MID、DBR和多核苷酸至少一部分的序列；以及(5)确定存在于来自每个样品的该多个测序衔接子附接的多核苷酸中的不同DBR序列的数量，以确定或估计已在测序步骤中测序的每个样品中的起始多核苷酸的数量。

附图简述

本发明通过以下详细说明在结合附图阅读时可以得到最好的理解。附图中包括以下各图：

图1显示了由指定量的起始材料（各图的顶部；以纳克为单位）制备的样品中各MID的等位基因比。

图2显示了在合成多态性位置与每个等位基因相关的各MID的DBR序列的分数。样品由指定量的起始材料（各图的顶部；以纳克为单位）制备。

图3显示了使用具有DBR序列的引物在PCR的前两个循环中产生的产物。

定义

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。另外，为了清楚和方便参考起见，下文将定义某些要素。