[发明专利]修饰的人类U1snRNA分子、编码修饰的人类U1snRNA分子的基因、包括该基因的表达载体及其在基因治疗中的用途

说明书

技术领域

本发明涉及修饰的人类snRNA分子（下文定名为外显子特异性U1——ExSpeU1），其适宜在基因治疗方法中使用。具体地，本发明涉及能够纠正由基因突变导致的并与通常非常严重的具有不同病史的人类疾病相关的异常剪接过程的snRNA分子。

背景技术

许多人类遗传疾病（约15%）由基因突变导致，其通过干扰正确的信使RNA细胞内成熟，损害随后准确的蛋白生物合成并诱导无功能的蛋白的合成而引起疾病。通常，造成剪接缺陷的点突变涉及对负责加工初级转录物的机器识别该初级转录物关键的基因序列。位于外显子-内含子交界处的供体和受体位点，以及外显子或内含子中的基因特异性调控元件（Cartegni L等人,2002；Pagani等人,2004）是其中最重要的序列。这些突变的结果可能引起多种分子事件，其最频繁地与将一个外显子排除在成熟转录物之外有关，即所谓的外显子遗漏（exon skipping）。

信使RNA的加工中的分子改变是长久已知的，其涉及例如外显子遗漏，代表多种人类疾病的主要发病机制，所述多种人类疾病其中的乙型血友病、囊性纤维化和脊髓型肌萎缩，其临床过程的严重度一致。不同类型的突变可诱导外显子遗漏和在供体位点（或5’剪接位点）中特异性的突变，在受体位点（3’剪接位点）中的突变，或外显子突变。作为引起外显子遗漏的不同类型的突变的例子，以下为所描述的人类疾病的三种模型。

凝血因子IX（FIX）中的缺陷是乙型血友病发病的原因，该病伴随不同程度的出血表现，有时非常严重并使人病废。在一些情况下，该病由剪接缺陷所导致。具体地，在剪接过程中，外显子5被排除出mRNA排除由因子IX基因（F9）的外显子5供体位点中的位置-2处的突变和受体位点中的多嘧啶序列中的位置-8和-9处的突变两者所导致。

目前乙型血友病治疗主要基于重组外源性FIX或直接取自血浆的FIX的频繁输注，其局限加强了研究以更高效力和长期效果为特征的替代方法的需要。

囊性纤维化（CF）在高加索人群中是最频繁致死的先天性遗传病：2500-2700个出生存活婴儿中就有一个新生儿罹患该病。

该病的病理发生续发于定名为CFTR（囊性纤维化跨膜传导调节因子）的蛋白的异常，该蛋白位于上皮细胞的顶膜并具有调节水电解质交换的功能。

作为CFTR改变的结果，盐通过细胞膜的传递被抑制，主要导致可定义为“脱水的”分泌物的产生：非常富集钠和氯的汗液与倾向于堵塞导管的浓密和粘稠的粘液，损害了多种器官和系统的功能。在一些研究的过程中，鉴定了CFTR基因序列中的许多改变与囊性纤维化相关联，其引起外显子遗漏。具体地，外显子12的遗漏由位于外显子自身的剪接供体位点中的突变和由外显子突变所导致。

脊髓型肌萎缩（SMA，OMIM253300，253550和253400）是隐性的常染色体神经肌肉病，以脊髓α运动神经元的变性为特征，具有估计的1/10,000出生儿的患病率。SMA相关联的临床症状范围从极其严重的出生后危险性肌张力低下和肌无力，到较晚在童年或青春期期间发病的较轻微的形式。迄今为止，尚未鉴定对于这种根据病史的严重度通常在一定年龄导致死亡的疾病的治疗。

在95%的病例中，疾病由SMN1基因的缺失所导致。在人类基因组中，存在与SMN1同源的基因，称作SMN2。然而，SMN2的表达由于外显子中的同义突变导致信使RNA的异常成熟和随后外显子7的遗漏并使基因自身失活而受损。设计的提高含外显子7的SMN2转录物的数目的方法将因此允许使用由于SMN2的正确表达而对于SMN1基因的缺失的补偿疗法，极大地暗示了为SMA的可能有效的治疗。

在剪接过程中，微核RNA（snRNA）作为负责介导整个mRNA成熟过程的细胞机器的剪接体的必需组分起主要作用。具体地，微小U1RNA（U1snRNA），长度为164核糖核苷酸，由在人类基因组中出现若干拷贝的基因所编码，且代表着核粒子U1snRNP的核糖核酸组分。U1snRNA分子具有茎和环三维结构，且其在5’区域包括通常长为9个核苷酸的单链序列，该单链序列能够通过互补性碱基配对结合前mRNA分子上的剪接供体位点（Horowitz等人,1994）。图1显示了野生型U1snRNA结构的示意图。显示了5’区域中能够识别剪接供体位点的序列与真核基因的初级转录物中的剪接供体位点的共有序列配对。这一序列表现出不同程度的保守，且位于外显子/内含子连接处。由U1snRNA5’区域介导的识别对于界定初级转录物上的外显子/内含子连接位点和剪接体复合物的正确组装是关键的。