[发明专利]凝胶粒子测定试剂及使用其的测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及在通过凝胶化反应使测定对象的试样中的内毒素和/或β-D-葡聚糖等目标物质凝胶粒子化后所使用的凝胶粒子测定试剂，特别是涉及试图早期（快速地）测定凝胶粒子开始出现的时间点的凝胶粒子测定试剂及使用其的测定方法。

背景技术

所谓的内毒素，主要是不被革兰氏染色法染色的（革兰氏阴性）菌的菌体膜成分的一部分，其成分是被称为脂多糖的脂质多糖类。具体地，是由被称作脂质A（Lipid A）的脂质和多糖链通过2-酮基-3-脱氧辛酸（KDO）结合而成的脂多糖（LPS），其中含有的被称为脂质A（Lipid A）的脂质结构部分通过感染进入人体时，与细胞的受体结合而引起炎症，在大多数情况下会引起各种各样的重度的临床症状。这样，内毒素是成为人类败血症或菌血症等致死率非常高的临床症状的原因的物质，因此，对进入到体内的内毒素进行评估在临床上的要求很高。

另外，药品（注射剂等）和血液制剂·医疗用具（血管导管等）或人工透析中的大量精制水等不被内毒素污染（无热原）是非常重要的，在使用细菌制备的药品（在重组蛋白质、基因治疗中使用的DNA等）或食品添加剂、化妆品等中，适当除去或控制内毒素是不可缺少的。

这种内毒素的除去确认或者急救医学中的计测，不仅要求测定的试样数多，而且还要求以救命治疗为目的的迅速性。

为了治疗败血症等，测量内毒素值的研究很早就开始了，人们发现鲎（Limulus）的阿米巴样血细胞成分中所含的基因组与内毒素发生特异性反应而成为凝集块堵塞伤口的现象，并据此尝试使用该鲎的阿米巴样血细胞水解物（Limulus Amebocyte Lysate；LAL试剂或鲎试剂）对内毒素进行定量测定。

最初的使用鲎试剂的测定方法，仅仅是将其与作为试样的患者血浆混合后静置，在一定时间后倒转过来，通过溶液的凝固来确认混合溶液是否凝胶化，根据引起凝胶化的最大稀释率来推算内毒素的量，这就是被称为所谓凝胶化法的半定量的测定方法。

随后，人们着眼于在凝胶化反应过程中浊度的增加，用采用光学测量方法的浊度计，根据伴随静置后的混合溶液的凝胶化反应的浊度变化来定量测定内毒素浓度，这是已知的比浊时间分析法。

而且，还已知有显色合成底物法，该方法是将鲎试剂反应过程的最终阶段的凝固蛋白原（Coagulogen）转换为凝固素（Coagulin）的凝胶化反应替换为合成底物的显色反应。该方法是通过加入显色合成底物（Boc-Leu-Gly-Arg-对硝基苯胺）来代替凝固过程中的凝固前体物质（凝固蛋白原：Coagulogen），通过其水解使对硝基苯胺游离，利用其黄色显色的比色来测定凝固蛋白原的分解能力，测定内毒素的浓度。

进而，作为以往的内毒素的测定方法，已经采用了例如专利文献1～5所记载的方法。

专利文献1是为了长时间精确度良好地测定水溶液中的内毒素浓度，在含有内毒素的水溶液中使对内毒素具有亲和性、且具有不会阻碍或促进内毒素与鲎的血细胞成分液体之间的反应的性质的水溶液的蛋白质共存，从而稳定化水溶液中的内毒素的方法。

专利文献2是为了抑制内毒素的活性，在含有内毒素的试样中使与内毒素相结合且具有抑制内毒素活性的性质的肽衍生物(或蛋白质)和表面活性剂共存的方法。

专利文献3是为了利用比浊时间分析法高灵敏度地检测内毒素等，在规定的水溶性聚合物的共存下使鲎的血细胞成分与含有内毒素和/或β-D-葡聚糖的试样混合，测定直至光学变化程度到达规定值的时间，根据所得时间与内毒素等的量的相互关系，求出试样中的内毒素等的量的方法。

专利文献4是为了在短时间内正确地测定内毒素和β-D-葡聚糖等利用凝胶化反应测定的物质的浓度，在通过凝胶化反应测定试样中的目标物质的测定装置中，对收纳有含有目标测定物质的检品和含有引起凝胶化的试剂的溶液的试样池照射发光二极管的照明光，利用搅拌棒搅拌试样中的溶液，产生微小而均匀的凝胶粒子，使它们通过照明光；进而，利用二极管检测在试样池中生成的凝胶粒子的透射光，基于该透射光检测输出，测定所产生的凝胶粒子的大小和量的变化，由此测定溶液中的上述物质的浓度的技术。