[发明专利]热稳定性木霉属纤维素酶

说明书

以引用方式并入本文

本申请要求2010年10月20日提交的系列号为61/394,946的美国临时申请和2010年10月20日提交的第10188285.0号欧洲专利申请的优先权。

前述申请，以及其中引证的或者在它们审查过程中引证的所有文件（“申请引证文件”）以及申请引证文件中引证或者参考的所有文件，以及本文引证或者参考的所有文件（“本文引证文件”）以及本文引证文件中引证或者参考的所有文件，还有关于在本文中或者在以引用方式并入本文的任何文件中提到的任何产品的任何生产商说明书、描述、产品规格和产品单，都以引用方式并入本文，并且可应用于本发明的实施。

技术领域

本发明涉及具有这样的修饰的木霉属(Trichoderma)例如里氏木霉(T.reesei)宿主细胞，该修饰包含据以防止或者减少热稳定性真菌纤维素酶（例如内切葡聚糖酶V(EGV)）的表达的中断或者缺失，或者该修饰实质上由该中断或者缺失组成，比如，具有这样的修饰的木霉属例如里氏木霉宿主细胞，该修饰包含参与EGV的表达的核苷酸中的一个或者多个缺失或者中断，或者该修饰实质上由该缺失或者中断组成，该修饰例如是这个纤维素酶的编码基因或者编码区或者用于这个纤维素酶的表达的启动子或者调节元件的中断或者缺失。这种宿主细胞特别可用于表达不含不需要的纤维素酶活性的热稳定性多肽。本发明有利地涉及包含和表达这样的外源核酸分子的木霉属例如里氏木霉，该核酸编码目的蛋白，例如编码疏水蛋白（例如疏水蛋白II），并具有这样的修饰，该修饰包含参与EGV的表达的核苷酸中的一个或者多个缺失或者中断，或者该修饰实质上由该缺失或者中断组成，由此目的蛋白例如疏水蛋白（如疏水蛋白II）得到表达，而EGV表达被防止或者减少。例如，该木霉属修饰可实质上由egl5的缺失或者中断组成。

背景技术

纤维素和半纤维素是通过光合作用产生的最丰富的植物材料。它们可被多种产生能够将聚合物底物水解成单体糖类的胞外酶类的微生物（例如细菌、酵母和真菌）降解和用作能源（Aro等人，(2001)，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)，276:24309-14）。

纤维素酶是水解纤维素（β-1,4-葡聚糖或者β-D-糖苷键）而导致葡萄糖、纤维二糖、纤维寡糖等的形成的酶类。传统上将纤维素酶分为三大类：内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)(“EG”)、外切葡聚糖酶或者纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91;“CBH”)和β-葡糖苷酶(β-D-葡糖苷葡萄糖水解酶；EC 3.2.1.21；“BG”)（Knowles等人，(1987)，TIBTECH 5:255-61；以及Schulein，(1988)，《酶学方法》(Methods Enzymol.)，160:234-43）。内切葡聚糖酶主要作用于纤维素纤维的无定形部分，以水解低结晶度区域中的内部β-1,4-糖苷键。纤维二糖水解酶从纤维素的还原端或者非还原端水解纤维二糖，并且能够降解结晶纤维素（Nevalainen和Penttila，(1995)，《真菌界》(Mycota)，303-319）。纤维二糖水解酶(CBH)在纤维素酶系统中的存在据认为是结晶纤维素的有效溶解所需（Suurnakki等人，(2000)，《纤维素》Cellulose，7:189-209）。β-葡糖苷酶起到从纤维二糖、纤维寡糖和其他葡萄糖苷释放D-葡萄糖单元的作用（Freer，(1993)，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)，268:9337-42）。β-葡糖苷酶还已被证实能催化水解烷基和/或芳基β-D-葡萄糖苷如甲基β-D-葡萄糖苷和对硝基苯基葡萄糖苷以及仅含碳水化合物残基的糖苷如纤维二糖。

已知纤维素酶由大量细菌、酵母和真菌产生。某些真菌能产生包括外切纤维二糖水解酶或者说CBH型纤维素酶、内切葡聚糖酶或者说EG型纤维素酶和β-葡糖苷酶或者说BG型纤维素酶的完全纤维素酶系统。其他真菌和细菌极少表达或者不表达CBH型纤维素酶。里氏木霉（也称红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)）能表达大量的纤维素酶，包括两种CBH，即CBHI(Cel7a)和CBHII(Cel6a)，至少八种EG，即EGI(Cel7b)、EGII(Cel5a)、EGIII(Cel12a)、EGIV(Cel61a)、EGV(Cel45a)、EGVI(Cel74a)、EGVII(Cel61b)和EGVIII(Cel5b)，和至少五种BG，即BG1(Cel3a)、BG2(Cel1a)、BG3(Cel3b)、BG4(Cel3c)和BG5(Cel1b)。EGIV、EGVI和EGVIII还具有木葡聚糖酶活性。