[发明专利]病毒基因组中的高度保守区序列作为设计治疗性sliRNA模板的应用

说明书

交叉引用

本申请要求2010年9月20日提交的美国申请第12/886,446号的权益，该美国申请的全部内容在此通过引用并入本文。

对序列表的引用

本申请包括通过EFS-Web以ASCII格式提交的序列表并且该序列表的全部内容在此通过引用并入本文。在2011年9月19日创建的ASCII副本的名称为Doc.No.4170050_1.txt，大小为9.28KB。

背景技术

小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）是带有特定基因密码的短双链RNA片段，功能长度一般为21-23核苷酸。siRNA与互补mRNA特异性结合，使靶定的mRNA降解并失去功能。这种由siRNA有效介导的转录后的基因沉默现象称之为RNAi（RNA干扰），其为自然存在于细胞中的防御机制。当双链RNA进入细胞内时，其被切割成带有21-25个核苷酸的siRNA片段。所述片段先与细胞内的其它成分结合以形成核酸蛋白复合体，称之为RNA诱导的沉默复合物（RISC）。激活的RISC通过碱基配对靶向到同源mRNA上，从而切割并降解mRNA，由此阻止细胞内特定的基因表达。siRNA不仅广泛应用于生物医学研究，而且在治疗多种疾病如病毒感染、癌症、血管疾病、神经系统疾病等具有广阔的前景。

年龄相关性黄斑变性（AMD）是50岁以上的人视力不可逆性损害的主要原因之一。AMD在临床上分为“干性”和“湿性”两型，湿性AMD发展快，是引起失明的主要原因。其病理变化导致严重的视力障碍。AMD的表现包括视网膜色素上皮细胞（RPE）功能受损和黄斑部脉络膜新生血管（CNV）。在一些严重病例中还会出现液体渗出，RPE或神经上皮的脱离，血管破裂造成出血性脱离。已发现许多细胞因子在CNV的生成过程中发挥着重要的调控作用，所述细胞因子包括血管内皮细胞生长因子（VEGF）、VEGF受体（VEGFR）、缺氧诱导因子（HIF）、血管生成素（Ang）和其它细胞因子，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）及其它。

已对RNAi在抑制CNV方面的效力做了测试，Cashman等的研究表明（Cashman SM等人，Invest Ophthalmol Vis Sci，2006；47(8)：3496-3504），将构建在腺病毒表达载体中的VEGF短发夹RNA（shRNA）玻璃体腔内注射于VEGF165诱导的CNV小鼠模型。该注射治疗可有效地抑制VEGF的过表达并且成功地阻止CNV的形成。证据显示shRNA腺病毒载体被递送（跨膜）至细胞质并引发RISC的活化，使目标RNA降解。由于人们对腺病毒载体在临床应用上的顾虑，尝试使用裸露（无传输介质）的VEGF siRNA使目标基因沉默。结果显示通过裸露的“siRNA”抑制VEGF表达确实降低了在小鼠模型中CNV的形成（Reich,S.J等人，Mol.Vis.2003；9：210–216）。

本领域仍然需要改良的、基于RNA的抑制剂，用于治疗如AMD和CNV的疾病。

发明内容

一方面，本发明提供了一种调节Toll样受体（TLR）的sliRNA，该sliRNA含有与病毒基因组序列的高度保守区的片段具有至少80%同源性的核苷酸序列。在一些实施方式中，所述核苷酸序列与高度保守区的片段具有至少85%、90%、95%、100%的同源性。在一些实施方式中，Toll样受体是Toll样受体3（TLR3）。在一些实施方式中，高度保守区位于病毒基因组的选自5'非翻译区（UTR）、3'UTR及开放阅读框（ORF）的区域。在一些实施方式中，病毒是选自脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、人肠道孤病毒、微小核糖核酸病毒、肠道病毒的人类病毒。在一些实施方式中，高度保守区序列位于SEQ ID NO:1的241-263位。在一些实施方式中，sliRNA包括双链RNA，该双链RNA可为平末端或可具有3’或5’突出端。在一些实施方式中，sliRNA的长度为14-25核苷酸。在一些实施方式中，sliRNA包括位于核苷酸序列的3’端的1～2个DNA碱基。

另一方面，本发明提供sliRNA，该sliRNA包含具有以下序列的双链RNA分子：

正义链：5’-UAGGUACUUCGAGAAGCCUAGUANn-3’(SEQ ID NO:14)

反义链：5’-UACUAGGCUUCUCGAAGUACCUANn-3’,(SEQ ID NO:15)

或：