[发明专利]细胞的表征

说明书

发明领域

本发明提供了非编码RNA分子在用于表征细胞和/或绘制细胞谱图的方法中的用途。具体地，在此说明的用途和方法可以用于评价细胞和/或细胞培养物的质量、同一性、纯度、潜能和安全性。

发明背景

生物技术和医药已经取得快速的进展，这导致了新的治疗方法和药品的发展，其中就包括含有活细胞的产品。这些新型的基于细胞的产品在各种未满足医疗需求的疾病的治疗方面具有很大潜力。对于干细胞，这些细胞产品直接用于治疗目的或是通过提供以下物质而辅助药物发现的研究工具，这些物质是干细胞、承诺分化为一种或多种谱系的细胞、或一种特定谱系的终末分化细胞的同质来源。研究中使用的哺乳动物细胞系是用于理解基本生物学概念的重要工具，而生物加工应用中使用的细胞可以产生出用于研究目的或临床应用的大分子。

当前的表征和安全性测试方法。

用于评价干细胞和细胞培养物的质量、一致性和潜能的方法有很多。对于干细胞，这被限定为它们自我更新的能力并且通过特异性标记物的表达来定义。必须定义所希望的细胞群的同一性。目前，使用一套标准化的指标来表征hESC系：表面抗原、特定酶活性的表达(例如碱性磷酸酯酶)、基因表达、表观遗传学标记、评价基因组稳定性、细胞学和形态学以及体外(胚体形成)和体内分化潜能(类畸胎瘤异体移植的形成)以及通过没有可测量的微生物感染来表征。然而，用于评价这些干细胞特征的操作需要有经验的工作人员，但是这些操作信息量相对较低并且是耗时和昂贵的。另外，它们没有揭示出所得细胞的安全特性和/或实用性方面的重要信息。对于低技能、低成本、信息丰富的QC测试以及报告干细胞系在衍生状态和在培养物中持续传代状态下的质量和一致性的试剂盒存在着一种需要，对于干细胞，这些测试和试剂盒包括细胞群在支持未分化细胞增殖条件下的扩增。这些QC检查还应该提供有关它们用于目的的可能的适合性的相关生物信息，以及如果被研发用于临床用途还提供它们利用的安全性。

对连续评价基于人的细胞产品的固有异质性存在着一种需要，以便寻求在基于细胞的起始材料的制造过程中将这种变化最小化。相应地，对于一种相对直接的测试存在着一种需要，该测试报告了培养的细胞的表型漂移，并且如果这些细胞被用作药品，提供了它们安全特性(例如致肿瘤性)的可能性评价。

微小RNA(miRNA)是单链RNA分子，长度是大约18至25个核苷酸。miRNA首先由Victor Ambros(维克托-安博斯)于1993年描述，并且自此以后关于miRNA已经出版了超过2000篇论文。预计人类有大约1,000个miRNA，但有些人估计这个数字为数万个。miRNA没有被翻译成蛋白质但却调节一种或多种基因的表达。目前，已知的生物学显示微小RNA靶向特定的单个信使RNA(mRNA)或mRNA组，由此防止它们进行翻译或加速mRNA的降解。成熟的单链miRNA分子与RNA诱导的沉默复合体(RISC)蛋白络合，并且结合到来自其目标基因、在编码蛋白质的mRNA的3’端非翻译区(3’-UTR)内的一个部分互补的序列上。

其他蛋白质被招募以便形成一种沉默复合物，并且目标基因产物的表达通过一种阻碍mRNA翻译的机制被抑制。

尽管miRNA的生物学信息以及该沉默复合物作用的组分和机制还有很多需要探索，但显而易见的是miRNA涉及许多基因的调节。miRNA被认为在翻译水平上调节了所有基因中的多达30％(Xie等，2005)。一个miRNA可以调节多个基因，并且每个基因可以由多个miRNA调节，从而允许组织和细胞内miRNA/mRNA网络之间复杂的相互关系。

miRNA的组织特异性表达被认为指导了细胞分化和/或主动维持细胞或组织同一性这一承诺。这种在不同miRNA之间大范围的影响和相互作用表明单一miRNA或小亚组miRNA的失调表达可能导致生理学或病理生理学的显著变化以及复杂的疾病特征(Lim等，2005)。超过50％的已知人类miRNA存在于癌细胞中容易改变的基因组区域中(Calin等，2004)。并不意外的是，miRNA的表达模式在癌症中和其他疾病状态中发生变化。这个信息已经开始用于对癌症分类和分期，揭示预后和响应的生物标记物，并且提供了一个关键性的决定因素来指导治疗性干预。

越来越多的证据证实单个miRNA的表达水平在多种细胞类型之间或维持在不同生理条件下的一种细胞类型中是显著不同的，因此可以用于确定细胞类型、该细胞的生理状态并且监测对环境变化的响应。