[发明专利]实时切割分析

权利要求书

1.一种样品分析的方法，包括:

使包括以下的反应混合物:

用于扩增核酸靶的PCR试剂，以及

于所述核酸靶上进行活瓣切割分析的活瓣切割试剂，经受如下热循环条件:

第一组5-15个循环:

i.至少90℃的第一温度;

ii.范围为60℃-75℃的第二温度;

iii.范围为65℃-75℃的第三温度;随后是:

第二组20-50个循环:

i.至少90℃的第四温度;

ii.比所述第二温度低至少l0℃的第五温度;

iii.范围为65℃-75℃的第六温度;

其中第一和第二组循环之间不向所述反应加入额外的试剂，并且，在第二组循环的每个循环中，测量活瓣探针的切割。

2.权利要求1的方法，其中所述方法包括在所述反应混合物处于所述第五温度时测定所述活瓣探针的切割。

3.权利要求1或2的方法，其中在所述20-50个循环的每个循环期间通过检测所述反应混合物的荧光测量所述活瓣探针的切割。

4.权利要求1-3任一项的方法，其中:

所述PCR试剂包括:核酸模板;第一PCR引物，第二PCR引物，热稳定的聚合酶，和核苷酸;以及

所述活瓣切割试剂包括:侵入寡核苷酸，活瓣探针，热稳定的活瓣核酸内切酶和FRET盒，

其中所述第一PCR引物和所述侵入寡核苷酸具有不同的核苷酸序列。

5.权利要求1-3任一项的方法，其中:

所述PCR试剂包括:核酸模板，第一PCR引物，第二PCR引物，热稳定的聚合酶，和核苷酸;以及

所述活瓣切割试剂包括:侵入寡核苷酸，活瓣探针，活瓣核酸内切酶和FRET盒，

其中所述第一PCR引物和所述侵入寡核苷酸具有相同的核苷酸序列。

6.权利要求5的方法，其中所述第一PCR引物和第二PCR引物以相同的浓度存在于所述反应混合物。

7.权利要求1-6任一项的方法，其中所述第四温度为50℃-55℃。

8.权利要求1-7任一项的方法，其中所述热循环条件包括第一组8-12个循环。

9.权利要求1-8任一项的方法，其中所述反应混合物体积为5μ1至50μ1，并且所述第一至第六温度的每一个独立地持续10秒至3分钟。

10.权利要求1-9任一项的方法，其中所述第二和第三温度是相同的温度。

11.权利要求Ll0任一项的方法，其中所述方法还包括对所述第二组每个循环发生的切割的量进行制图，从而提供所述核酸靶的所述突变丰度的评价。

12.权利要求1-11任一项的方法，其中所述活瓣切割分析检测所述核酸靶的突变。

13.一种进行样品分析的装置，其包括:

a)热循环仪，其被编排用于进行下述热循环条件:

第一组5-15个循环:

i.至少90℃的第一温度;

ii.范围为60℃-75℃的第二温度;

iii.范围为65℃-75℃的第三温度;随后是:

第二组20-50个循环:

i.至少90℃的第四温度;

ii.比第二温度低至少l0C的第五温度;

iii.范围为65℃-75℃的第六温度;以及

b)容器，其包含:

用于扩增核酸靶的PCR试剂，以及

于所述核酸靶上进行活瓣切割分析的活瓣切割试剂。