[发明专利]实时切割分析

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2010年11月15日递交的美国专利申请系列号12/946，737的申请日的优先权，该申请公开的内容通过引入的方式并入本文。

背景

人类基因组中的一些点突变与疾病有直接关联。例如，发现一些生殖系KRAS突变与努南综合征(Schubbert等人.Nat.Genet.200638:331-6)和心-面-皮肤综合征(Niihori等人.Nat.Genet.200638:294-6)相关联。同样，发现体细胞的KRAS突变在白血病、结直肠癌(Burmer等人.Proc.Natl.Acad.Sci.198986:2403-7)、胰腺癌(Almoguera等人.CeIl198853:549-54)和肺癌(Tam等人.Clin.Cancer ReS.200612:1647-53)中高频出现。人类基因组中有许多点突变与疾病没有明显的致病关联。

点突变的检测方法可用于，例如，提供与点突变相关联的疾病的诊断。

概述

本发明提供基于切割的实时PCR分析方法。在某些实施方案中，所述分析方法包括使包括a)扩增核酸靶的PCR试剂、和b)对所扩增的核酸靶进行活瓣(flap)切割分析的活瓣切割试剂的反应混合物经受两组热循环条件。第一组热循环条件包括一组5-15个以下循环:i.至少90℃的第一温度;ii.范围为60℃-75℃的第二温度;iii.范围为65℃-75℃的第三温度。所述第二温度和第三温度可以相同。第二组热循环条件包括一组20-50个以下循环:i.至少90℃的第四温度;ii.比第二温度低至少l0℃的第五温度;iii.范围为65℃-75℃的第六温度。在某些情况下，第一组和第二组循环之间不向反应加入额外的试剂，并且，在第二组循环的每个循环中，测定活瓣探针的切割。

附图简述

图1示意性说明了活瓣分析的一些一般原则。

图2显示使用单阶段热循环完成的分析的结果。野生型中存在的KRASG35T突变序列水平的检测和定量如图所示。动力学曲线显示突变体与野生型的所有比例除了1:l0和1:100之外的是无法区分的。

图3显示使用两个阶段热循环完成的分析的结果。野生型中存在的KRALSG35T突变序列水平的检测和定量如图所示。动力学曲线显示比例从1:10至1:10，000的分辨率。

定义

本文使用的术语“样品”涉及材料或材料的混合物，通常情况下，尽管这不是必须的，以液体形式，含有一种或多种感兴趣的分析物。

术语“核苷酸”旨在包括那些不仅包含已知嘌呤和嘧啶碱基而且包含已被修饰的其他杂环碱基的基团(moieties)。这些修饰包括甲基化的嘌呤或嘧啶，酰基化的嘌呤或嘧啶，烷基化的核糖或其他杂环。此外，术语“核苷酸”包括那些包含半抗原或荧光标记并可以不仅包含常规核糖和脱氧核糖的糖，而且也可以包含其他糖的基团。修饰的核苷或核苷酸也包括对所述糖基团的修饰，例如，一个或多个羟基被卤素原子或脂肪族基团取代，官能化为醚、胺等。

术语“核酸”和“寡核苷酸”在本文中可以互换使用，用于描述任意长度的聚合物，例如，长于大约2个碱基，长于大约10个碱基，长于大约100个碱基，长于大约500个碱基，长于大约1000个碱基，长达大约10，000个或更多碱基组成的核苷酸，例如，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，并可通过酶法或合成法制备(例如，PNA记载于美国专利号5，948，902和其中所引用的参考文献)其可以与天然存在的核酸以序列特异性的方式进行杂交，该方式与两种天然存在的核酸杂交类似，例如，能够参与沃森-克里克碱基配对相互作用。天然存在的核苷酸包括鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和胸腺嘧啶(分别为G、C、A和T)。

本文使用的术语“核酸样品”指含有核酸的样品。

本文使用的术语“靶多核苷酸”指研究中的目的多核苷酸。在某些实施方案中，靶多核苷酸含有研究中的一个或多个目的靶位点。

本文使用的术语“寡核苷酸”指大约2至200个核苷酸的核苷酸单链多聚体。寡核苷酸可以通过合成或可以通过酶法制备，并且，在一些实施方案中，长度为10至50个核苷酸。寡核苷酸可以含有核糖核苷酸单体(即，可以为寡核糖核苷酸)或脱氧核糖核苷酸单体。例如，寡核苷酸的长度可以为10至20、11至30、31至40、41至50、51至60。61至70、71至80、80至100、100至150或150至200个核苷酸。

本文使用的术语“双链体”或“双链的”描述两个互补的碱基配对的多核苷酸，即，杂交在一起。