[发明专利]用于产生自组装蛋白质的高浓缩溶液的方法

说明书

本发明涉及稳定水性蛋白质分散体，其在水相中包含至少一种分散形式的自组装蛋白质，以及至少一种用于该自组装蛋白质的特异性分散剂；用于产生这类稳定水性分散体的方法；用于使用这类稳定水性分散体电纺丝自组装蛋白质的方法；用于从这类水性分散体产生纤维片状体或纤维的方法；这类水性分散体在涂布表面中的用途；通过电纺丝产生的材料在制备医疗器械、卫生用品和织物中的用途；以及通过本发明的电纺丝法产生的纤维状或纤维片状体。

现有技术

电纺丝法是用于产生纳米纤维(nanofiber)和中间纤维(mesofiber)的优选方法。此方法例如由D.H.Reneker，H.D.Chun在Nanotechn.7(1996)，第216页及之后页中描述，通常包括使聚合物熔化物或溶液在作为电极的边缘处暴露于高电场。这可以例如通过在低压力下在电场中使聚合物熔化物或溶液经与电源一极连接的套管挤出来达到。由于聚合物熔化物或溶液上产生的静电电荷，材料流将向反电极方向流动，仅在其至反电极的途中固化。取决于电极的几何形状，此方法提供纤维状无纺网(即无纺布)或有序纤维的组件。

天然起始材料(如生物聚合物或从其衍生的合成聚合物)也可通过电纺丝来加工。

一个实例是Zarkoob和Reneker(Polymer45：3973-3977，2004)所描述的通过电纺丝将蜘蛛(金纺蜘蛛(Nephila clavipes))的蜘蛛丝蛋白质从六氟-2-丙醇溶液加工为纳米纤维。Sukigara和Ko(Polymer44：5721-572，2003)描述了从甲酸溶液纺织家蚕(Bombyx mori)丝的尝试，他们改变电纺丝参数来影响纤维形态。Jin和Kaplan报道了丝或丝/聚环氧乙烷的基于水的电纺丝(Biomacromolecules3：1233-1239，2002)。

WO-A-03/060099描述了用于纺丝家蚕丝蛋白质和蜘蛛丝蛋白质的多种方法(包括电纺丝)和装置。通过转基因山羊重组产生所使用的蜘蛛丝蛋白质，从它们的乳汁回收，然后纺丝。

由昆虫蛋白质节肢弹性蛋白或分别称为R16和S16的蜘蛛丝蛋白质的重复单位构成的合成生物聚合物描述于共同受让的WO2008/155304中。微球形式的聚合物可以例如转化为凝胶状产品或加工为蛋白质膜。

可选地与药物活性物质或农业化学活性物质混合的聚合物(例如合成的生物聚合物或其他可纺丝的有机聚合物，或其相互协调的聚合混合物)的电纺丝描述于共同受让的WO2010/015709和WO2010/015419中。用有机溶剂或浓缩甲酸中的聚合物溶液作为纺丝溶液。

WO2010/015419中概括地提到R16或S16的水溶液一般可纺丝。但是，这类水溶液存在根本的问题，因为它们缺乏稳定性，尤其是在比较高的蛋白质浓度下缺乏稳定性，这导致溶液中不想要的胶凝作用或沉淀作用。

实际上，可以利用已知的离液试剂来大幅提高这类可纺丝的疏水蛋白质的溶解度。实验观察到的在10M硫氰酸胍(GdmSCN)溶液中的最高溶解度为约38％。但是，通过透析再次去除GdmSCN时，蛋白质沉淀。

发明概述

由于高度疏水的蛋白质(如R16蛋白质)例如在水中的低溶解度(最大约1％)，本发明的目的是开发可纺丝系统，由此将蛋白质以比较高的浓度稳定在待纺丝的液相中。

本发明为避免蛋白质从水溶液沉淀(透析期间)的问题提供的第一解决方案包括用在其结构中同样包含疏水部分的亲水蛋白质稳定疏水蛋白质。更具体而言，实验显示，牛血清白蛋白(BSA，级分V)符合这些要求。牛血清白蛋白是在血液中执行脂肪酸和脂质的转运蛋白功能的可溶性蛋白质。BSA由607个氨基酸组成，具有约69.4kDa的分子量。无脂肪BSA(ffBSA)是BSA的具体实施方案，其中存在通过去除脂肪酸而产生的附加疏水部位。

本发明为上述问题提供的第二解决方案包括借助适宜的蛋白质片段(肽)来稳定疏水蛋白质。本发明的蛋白质片段包含亲水以及疏水的序列结构域。更具体而言，提供两个基于肽的系统：

a)借助R16蛋白质的蛋白质片段来稳定天然R16蛋白质；

b)借助BSA的蛋白质片段来稳定天然R16蛋白质。

以常规方式(例如利用80℃的NaOH溶液)实现蛋白质的各水解分裂来产生稳定蛋白质片段。