[发明专利]用于切除靶核酸的核酸、组合物和方法

说明书

本申请要求申请日为2010年8月30日的美国临时申请号61/378,350的优先权，其全部内容通过引用并入本申请。

1.技术领域

本申请提供的核酸、组合物、和方法通常涉及分子生物学和基因工程领域。

2.背景技术

在很多领域，包括代谢工程、工业微生物学、合成生物学、和基础分子遗传学研究中，都需要利用基因工程技术从宿主细胞基因组或游离基因中切除靶核酸。然而，此前用于除去靶核酸的方法在应用方面受到了约束和限制。例如，利用位点特异性重组酶方法除去会遗留有害的特异性重组酶结合位点，这些位点会在宿主细胞中产生潜在的基因组不稳定性。其他方法产生切除事件的频率较低，因而，有必要找到一些方法，通过生长选择经历切除事件的稀有宿主细胞。需要提供一种核酸、组合物、和方法，用于从宿主细胞基因组或游离基因中高频率和高精确度地切除靶核酸，而不会产生潜在的基因组不稳定性。

3.发明概述

本申请提供了一种核酸、组合物、和方法，用于切除宿主细胞基因组的一个或多个基因座。第一方面，本申请提供了一种可切除的核酸构建体，从5’至3’方向包括：a）第一串联重复核酸，b）第一归巢核酸内切酶识别位点，c）靶核酸，d）第二归巢核酸内切酶识别位点以及e）第二串联重复核酸。在某些实施方式中，可切除的核酸构建体整合至宿主细胞基因组中。在某些实施方式中，第二归巢核酸内切酶识别位点是可选的。

第一和第二归巢核酸内切酶识别位点用于归巢核酸内切酶剪切可切除的核酸构建体。归巢核酸内切酶与归巢核酸内切酶识别位点结合能够剪切位于或邻近归巢核酸内切酶识别位点的可切除的核酸构建体。在某些实施方式中，每个第一和第二归巢核酸内切酶识别位点独立地包含14-40个核苷酸碱基对。在某些实施方式中，每个第一和第二归巢核酸内切酶识别位点独立地由14-40个核苷酸碱基对组成。在某些实施方式中，每个归巢核酸内切酶识别位点独立地由20-40个核苷酸碱基对组成。在某些实施方式中，每个归巢核酸内切酶识别位点独立地由25-40个核苷酸碱基对组成。在某些实施方式中，每个归巢核酸内切酶识别位点独立地由30-40个核苷酸碱基对组成。在某些实施方式中，每个归巢核酸内切酶识别位点独立地由35-40个核苷酸碱基对组成。在某些实施方式中，每个归巢核酸内切酶识别位点独立地由24个核苷酸碱基对组成。

在某些实施方式中，第一或第二归巢核酸内切酶识别位点中的至少一个是选自下组的归巢核酸内切酶的识别位点：LAGLIDADG（SEQ ID NO:1）归巢核酸内切酶、HNH归巢核酸内切酶、His-Cys盒归巢核酸内切酶、GIY-YIG（SEQ ID NO:2）归巢核酸内切酶、和蓝藻归巢核酸内切酶。在某些实施方式中，每个第一和第二归巢核酸内切酶识别位点独立地选自下组的归巢核酸内切酶的识别位点：LAGLIDADG（SEQ ID NO:1）归巢核酸内切酶、HNH归巢核酸内切酶、His-Cys盒归巢核酸内切酶、GIY-YIG（SEQ ID NO:2）归巢核酸内切酶、和蓝藻归巢核酸内切酶。

在某些实施方式中，第一或第二归巢核酸内切酶识别位点中的至少一个是选自下组的归巢核酸内切酶的识别位点：I-CreI、I-MsoI、I-SceI、I-SceIV、H-DreI、I-HmuI、I-PpoI、I-DirI、I-NjaI、I-NanI、I-NitI、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、F-TevI、F-TevII、F-CphI、PI-MgaI、I-CsmI、I-CeuI、和PI-SceI。

在一些实施方式中，每个第一和第二归巢核酸内切酶识别位点独立地选自下组的归巢核酸内切酶的识别位点：I-CreI、I-MsoI、I-SceI、I-SceIV、H-DreI、I-HmuI、I-PpoI、I-DirI、I-NjaI、I-NanI、I-NitI、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、F-TevI、F-TevII、F-CphI、PI-MgaI、I-CsmI、I-CeuI、和PI-SceI。在特定实施方式中，第一或第二归巢核酸内切酶识别位点中的至少一个是I-SceI识别位点。在特定实施方式中，第一或第二归巢核酸内切酶识别位点中的至少一个是F-CphI识别位点。