[发明专利]新表达载体

权利要求书

1.表达载体，它是用于使蛋白质表达的表达载体，其特征在于，包括基因表达调控位点以及位于其下游的编码该蛋白质的基因、进一步位于下游的内部核糖体进入位点和进一步位于下游的编码谷氨酰胺合成酶的基因。

2.如权利要求1的表达载体，其特征在于，该基因表达调控位点选自来源于巨细胞病毒的启动子、SV40初期启动子、延伸因子1启动子。

3.如权利要求1或2的表达载体，其特征在于，该内部核糖体进入位点来源于选自微小核糖核酸病毒科的病毒、口蹄疫病毒、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、冠状病毒、牛肠道病毒、泰勒氏小鼠脑脊髓炎病毒、柯萨奇病毒B型病毒、人免疫球蛋白重链结合蛋白基因、果蝇触角足基因、果蝇超双胸基因的病毒或基因的5’非翻译区。

4.如权利要求1或2的表达载体，其特征在于，该内部核糖体进入位点来源于微小核糖核酸病毒科的病毒的5’非翻译区。

5.如权利要求1或2的表达载体，其特征在于，该内部核糖体进入位点来源于小鼠脑心肌炎病毒的5’非翻译区。

6.如权利要求1～5中的任一项的表达载体，其特征在于，该内部核糖体进入位点是在野生型的内部核糖体进入位点的碱基序列中加入了1个或2个以上的突变的位点。

7.如权利要求6的表达载体，其特征在于，在该内部核糖体进入位点存在多个起始密码子，其中的一部分被破坏。

8.如权利要求5的表达载体，其特征在于，该内部核糖体进入位点包含序列编号1的碱基序列。

9.如权利要求5的表达载体，其特征在于，该内部核糖体进入位点包含序列编号2的碱基序列。

10.如权利要求5的表达载体，其特征在于，该内部核糖体进入位点包含序列编号3的碱基序列。

11.如权利要求5的表达载体，其特征在于，该内部核糖体进入位点包含序列编号4的碱基序列。

12.如权利要求5的表达载体，其特征在于，该内部核糖体进入位点包含序列编号5的碱基序列。

13.如权利要求5的表达载体，其特征在于，该内部核糖体进入位点包含序列编号6的碱基序列。

14.如权利要求1～13中的任一项的表达载体，其特征在于，在编码蛋白质的该基因与该内部核糖体进入位点之间的区域或编码谷氨酰胺合成酶的该基因的下游区域，除该内部核糖体进入位点之外，还包含其它内部核糖体进入位点及位于其下游的耐药性基因。

15.如权利要求1～13中的任一项的表达载体，其特征在于，除该基因表达调控位点之外，还包含其它基因表达调控位点及位于其下游的耐药性基因。

16.如权利要求14或15的表达载体，其特征在于，该耐药性基因为嘌呤霉素抗性基因或新霉素抗性基因。

17.如权利要求1～16中的任一项的表达载体，其特征在于，编码蛋白质的该基因为来源于人的基因。

18.如权利要求17的表达载体，其特征在于，来源于人的该基因选自编码溶酶体酶、组织型纤溶酶原激活物(t-PA)、凝血因子、红细胞生成素、干扰素、血栓调节蛋白、卵泡刺激素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和抗体的基因。

19.如权利要求17的表达载体，其特征在于，来源于人的该基因为编码溶酶体酶的基因。

20.如权利要求19的表达载体，其特征在于，该溶酶体酶选自α-半乳糖苷酶A、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、葡糖脑苷脂酶、加硫酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、酸性α-葡糖苷酶。

21.如权利要求17的表达载体，其特征在于，来源于人的该基因为编码红细胞生成素的基因。

22.哺乳动物细胞，其特征在于，通过权利要求1～21中的任一项的表达载体进行了转化。

23.如权利要求22的细胞，其特征在于，该哺乳动物细胞为CHO细胞。

24.使编码蛋白质的基因表达的转化细胞的制造方法，其特征在于，包括：将上述[1]～[21]中的任一项的表达载体导入哺乳动物细胞的步骤；将导入了该表达载体的哺乳动物细胞在谷氨酰胺合成酶抑制剂的存在下或者谷氨酰胺合成酶抑制剂和与耐药性基因对应的药剂的存在下进行筛选培养的步骤。