[发明专利]新表达载体

说明书

技术领域

本发明涉及用于使重组体蛋白质在哺乳动物细胞内高效地表达的新表达载体，具体涉及包括基因表达调控位点、位于其下游的编码所需蛋白质的基因、进一步位于下游的内部核糖体进入位点和进一步位于下游的编码谷氨酰胺合成酶的基因的表达载体。

背景技术

使用通过整合有编码所需蛋白质的基因的表达载体转化的哺乳动物细胞来制造重组体蛋白质的方法是在医药品制造等工业领域中广泛普及的技术，α-半乳糖苷酶A、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、葡糖脑苷脂酶、加硫酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、酸性α-葡糖苷酶等溶酶体酶、组织型纤溶酶原激活物(t-PA)、凝血因子Ⅶ、凝血因子Ⅷ、凝血因子Ⅸ等凝血因子、红细胞生成素、干扰素、血栓调节蛋白、卵泡刺激素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、各种抗体药物等使用该技术制造，作为医药品在市场上销售。

这时，作为表达载体，一般采用在诱导强基因表达的基因调控位点、例如来源于巨细胞病毒(CMV)的启动子、SV40初期启动子、延伸因子1α(EF-1)启动子等的下游整合有编码所需蛋白质的基因的表达载体。导入了这样的表达载体的哺乳动物细胞可表达整合至表达载体的所需蛋白质，其表达量根据各个细胞而不同，并不一致。因此，为了高效地生产重组体蛋白质，需要从导入了表达载体的哺乳动物细胞中筛选所需蛋白质的表达水平高的细胞的步骤。为了进行该筛选，表达载体整合有起到筛选标记物的作用的基因。

作为筛选标记物，最一般的是分解嘌呤霉素、新霉素等药剂的酶(耐药性标记物)。哺乳动物细胞在一定浓度以上的上述药剂的存在下死亡。但是，导入了表达载体的哺乳动物细胞可通过整合至表达载体中的药剂筛选标记物分解上述药剂，将其无毒化或低毒化，所以在上述药剂的存在下也可生存。因此，如果在含有一定浓度的上述药剂的培养基中培养导入了表达载体的细胞，仅以高水平表达药剂筛选标记物的细胞增殖，结果筛选出那些细胞。以高水平表达药剂筛选标记物的细胞存在同时整合至表达载体中的编码所需蛋白质的基因也以高水平表达的倾向，所以结果获得以高水平表达所需蛋白质的哺乳动物细胞。

作为筛选标记物，还已知使用谷氨酰胺合成酶(GS)的表达载体(参照专利文献1、2)。谷氨酰胺合成酶是由谷氨酸和氨合成谷氨酰胺的酶。如果将哺乳动物细胞在作为谷氨酰胺合成酶的抑制剂的一定浓度的蛋氨酸磺酸盐(MSX)的存在下用谷氨酰胺缺陷培养基进行培养，则细胞死亡。但是，如果将作为筛选标记物整合了谷氨酰胺合成酶的表达载体导入哺乳动物细胞，则该细胞中谷氨酰胺合成酶的表达水平上升，所以在更高浓度的MSX的存在下也可增殖。这时，如果使MSX的浓度逐渐上升的同时继续培养，则可获得在更高浓度的MSX的存在下也可增殖的细胞。该现象被认为是因整合至哺乳动物细胞的基因组内的该表达载体在基因组内进行复制来增加拷贝数而引发。即，由于拷贝数增加，一个细胞中的基因组内存在的药剂筛选标记物的基因数增加，基因的表达量相对增加。这时，整合至表达载体中的编码所需蛋白质的基因的拷贝数也复制而增加，所以可获得以高水平表达所需蛋白质的哺乳动物细胞。例如，专利文献1中记载，通过使用GS表达载体和蛋氨酸磺酸盐(MSX)，与使用DHFP(二氢叶酸还原酶)/MTX(甲氨蝶呤)的情况相比，可实现更高的拷贝数。此外，专利文献2中记载，通过使用GS基因和MSX，宿主细胞的DNA中，随着GS基因的拷贝数的增加，也可以使与之不同的异型基因的拷贝数也增加，由此可增加所需多肽的生产水平。

如上所述，含筛选标记物的表达载体适合于效率良好的重组体蛋白质的制造，得到广泛应用。表达载体上，编码所需蛋白质的基因和编码筛选标记物的基因一般分别整合至不同的基因调控位点下(参照专利文献3)。但是，还已知一个基因调控位点下串联整合编码所需蛋白质和筛选标记物的基因使其表达的方法(参照专利文献4、5、6、7)，这时在编码所需蛋白质和筛选标记物的基因之间插入有内部核糖体进入位点(IRES:internal ribosome entry site)等，由此可由一个基因调控位点表达2个基因。内部核糖体进入位点已知有多种，有来源于例如微小核糖核酸病毒、脊髓灰质炎病毒、脑心肌炎病毒、鸡传染性法氏囊病病毒的位点(参照专利文献8、9、10)。

作为应用内部核糖体进入位点的表达载体，已知在内部核糖体进入位点的下游作为筛选标记物整合有单纯疱疹病毒胸苷激酶的表达载体(参照专利文献11)、使用2个以上的内部核糖体进入位点结合有3种以上的基因的表达载体(参照专利文献12)。