[发明专利]转基因植物

说明书

本发明涉及可以用于制备转基因植物的基因构建体。构建体可以具有降低植物特别是植物的叶子中硝酸盐浓度和用于诱导衰老样表型的能力。本发明扩展至用这种构建体转化的植物细胞和转基因植物本身。本发明还涉及产生转基因植物的方法和在植物中降低硝酸盐含量的方法。本发明还涉及已用基因构建体转化的收获的植物叶(例如烟草叶)和包含这种收获的植物叶的各种烟草制品(比如吸烟制品)。

氮同化对于植物生长具有根本重要性。在植物所需的所有矿物质营养物中，氮是最大丰度需要的。在田间植物摄取的氮的主要形式是硝酸盐和氨，其是氮肥的主要组分。根据可用性，植物从土壤中摄取硝酸盐或铵离子。硝酸盐在充足氧化的非酸性土壤中更丰富，而铵在酸性或积水土壤中占优势。对烟草生长参数的实验清楚地表明，相对生长速率、叶绿素含量、叶面积和根面积响应于渐增的硝酸盐供应而急剧增加。

根通过特定硝酸盐转运蛋白(NTR)的作用摄取硝酸盐和氨。在植物中，存在对于硝酸盐具有不同的亲和力的不同的转运系统。然后硝酸盐在根部中通过细胞质酶硝酸还原酶(NR)而还原且进入氮同化通路，或者它被转运至木质部的枝条(shoots)。硝酸盐从根部的表皮和皮层细胞转运且进入脉管系统而被转运至枝条。它经由质外体进入叶子且被穿过质膜转运至叶肉细胞。在这里，它被储存在液泡中，或在细胞质中被还原，且进入主要氮同化通路。当硝酸盐过量存在时，它被储存在液泡中。这既充当渗压剂(即补充渗透压)，又充当在硝酸盐摄取最少时待使用的矿物质氮来源。存在于细胞质中的硝酸盐是主要氮同化的起点。

硝酸盐在细胞质中被细胞质酶硝酸还原酶(NR)还原为亚硝酸盐，其本身在叶子的叶绿体或非光合器官的质体中被亚硝酸盐还原酶(NIR)迅速还原。在叶绿体中，然后铵进入谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合酶循环(GS/GOGAT)，在那里它被并入氨基酸合并物中。

硝酸盐转运蛋白、和硝酸盐和亚硝酸盐还原酶的活性调节在整个植物中控制主要氮同化中是关键的，且对于植物的生长和发育具有显著影响。然而，在某些条件下，硝酸盐可能积聚，主要是在绿色光合活跃组织中积聚，在那里它被储存在叶肉细胞的液泡中。当具有较少同化储存的硝酸盐的光合能力时，或作为土壤中高硝酸盐水平的结果，高水平的硝酸盐聚集可以发生在低温和/或太阳辐射(例如，在冬季期间的温室作物中)期间。硝酸盐水平的增加可以具有许多有害后果，不仅在植物生长的方面，而且在消耗植物的人或动物健康以及环境后果的方面。硝酸盐聚集的许多不利后果通过产生亚硝酸盐所介导。

因此，为了防止硝酸盐聚集，一个策略将是增加植物中的氮再动员(nitrogen remobilisation)，例如当它们变得衰老时，这可能在作物生产中具有重要应用。首先，从叶中再动员起来的氮可转运到较幼嫩的叶以及发育中的种子中。因此，氮从衰老叶中离去的效率的提高可潜在地增加植物种子和较幼嫩部分的氮供应，从而提高作物产量和氮利用效率。在世界人口增加但作物产量的增加不足以满足需要时，这显然是有价值的目标。一种潜在的目标作物是欧洲油菜(Brassica napus) (油菜)，其由于营养组织的氮素再动员差而造成氮效率低下。另一种目标作物是小麦，因为增加籽粒蛋白含量的潜在益处较大。籽粒蛋白含量不仅影响小麦的营养价值，而且还决定籽粒使用率，并由此决定市场价值。例如，籽粒蛋白含量增加引起面包体积增加。

同样，在烟草工业中提高氮素再动员的能力可能十分有用，因为如图1所示，已知烟草叶中残留的氮有助于形成亚硝胺类。具体而言，硝酸盐和亚硝酸盐在烤叶中充当烟草特异性亚硝胺(TSNA)形成的前体。此外，亚硝胺在胃中的形成是由于内源性亚硝化作用。口腔细菌将食物和饮料中消耗的硝酸盐化学还原为亚硝酸盐，所述亚硝酸盐在胃的酸性环境中可以形成亚硝基化剂。这些与胺反应产生亚硝胺，且引起DNA链断裂或DNA的交联。与过量的硝酸盐有关的另一个问题是正铁血红蛋白的形成，其产生蓝婴综合症(blue baby syndrome)，其中血红蛋白的携氧能力被亚硝酸盐所封闭，在婴儿中引起化学窒息。

作为这些健康问题的后果，根据收获的时间，许多监管机构对于绿叶蔬菜如菠菜和生菜中允许的硝酸盐的量设置了限制(例如，欧洲委员会法规653/2003)。这些限制已经导致任何高硝酸盐含量的农产品滞销。因此，已经通过管理含氮化肥的或改进的种植业系统的应用而进行降低植物的硝酸盐含量的努力。一些机构也已经对于饮用水中硝酸盐的量设置了限制。

因此，存在对于用于缓解植物中与硝酸盐聚集有关的不利影响的方式的需要。考虑到这一点，本发明人已经开发了一系列基因构建体，其可用于转基因植物的制备中，所述转基因植物表现出令人惊讶的降低的硝酸盐浓度。