[发明专利]天然延伸平行测序

说明书

交叉引用

本申请要求均提交于2011年9月23日的美国申请61/385,562和61/385,947的权益，该美国申请通过引用整体并入本文。

发明背景

微生物检测和鉴定，以及个体实际鉴定，例如，亲权鉴定和法医学(Reynolds等人，Anal.Chem.，63：2-15(1991))，器官移植供体-受体配型(Buyse等人，Tissue Antigens，41：1-14(1993)和Gyllensten等人，PCR Meth.Appl.1：91-98(1991))，遗传疾病诊断、预测和产前咨询(Chamberlain等人，Nucleic Acids Res.，16：11141-11156(1988)和L.C.Tsui，Human Mutat.，1：197-203(1992))，以及药物代谢和致癌突变研究(Hollstein等人，Science，253：49-53(1991))，需要具有成本效益的和快速的测序。另外，通过核酸分析进行传染病诊断的成本效益直接随批量测试的多重规模而变化。这些应用很多依赖于对大量有时为紧密排列的基因座处的单碱基差异的区分。

可以使用多种DNA杂交技术检测在含有大量序列区域的样品中一种或多种选定的多核苷酸序列的存在。在一种依赖于片段捕获和标记的简单方法中，含有选定的序列的片段通过与固定的探针杂交而被捕获。捕获的片段可以通过与含有可检测的报告部分的第二探针杂交而进行标记。

另一广泛应用的方法是Southern印迹法。在该方法中，通过凝胶电泳对样品中的DNA片段混合物进行分级分离，随后将其固定于硝酸纤维素滤纸上。通过将滤纸与一种或多种标记的探针在杂交条件下反应，可以鉴定含有探针序列的条带的存在。该方法对于鉴定DNA限制性酶切消化物中含有给定探针序列的片段和分析限制性片段长度多态性(“RFLP”)特别有用。

另一种检测多核苷酸样品中一种或多种给定序列的存在的方法涉及通过聚合酶链式反应对该序列的选择性扩增。Mullis等人的美国专利4,683,202和R.K.Saiki等人，Science230：1350(1985)。在该方法中，使用互补于选定序列的相对端部分的引物配合热循环来推进引物启动的复制的连续循环。扩增的序列可以很容易地通过多种技术进行鉴定。该方法特别可用于检测含多核苷酸样品中的低拷贝序列的存在，例如，用于检测体液样品中的病原体序列。

最近，报道了通过探针连接方法来鉴定已知靶序列的方法。N.M.Whiteley等人的美国专利4,883,750；D.Y.Wu等人，Genomics4：560(1989)；U.Landegren等人，Science241：1077(1988)；和E.Winn-Deen等人，Clin.Chem.37：1522(1991)。在一种被称为寡核苷酸连接分析(“OLA”)的方法中，将跨越感兴趣的靶区域的两条探针或探针元件与靶区域杂交。在探针元件与相邻靶碱基进行碱基配对的位置，可以通过连接，例如通过连接酶处理，将探针元件的相对末端连接起来。然后分析连接的探针元件，以证实靶序列的存在。

在该方法的改进形式中，连接的探针元件作为一对互补探针元件的模板。在探针元件对的存在下，经过连续的变性、杂交和连接的循环，将靶序列线性扩增，使得非常少量的靶序列能够得到检测和/或扩增。该方法被称为连接酶检测反应。当使用两个互补探针元件对的时候，该方法被称为连接酶链式反应，其实现了靶序列的指数扩增。F.Barany，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA，88：189-93(1991)和F.Barany，PCR Methods and Applications，1：5-16(1991)。

Grossman等人的美国专利5,470,705公开了用于多重检测核酸序列差异的另一方案，其中可将具有可检测标记物和独特的电荷/翻译摩擦阻力(charge/translational frictional drag)比例的序列特异性探针与靶标杂交并连接在一起。该技术在Grossman等人，Nucl.Acids Res.22(21)：4527-34(1994)中用于囊性纤维化跨膜调节基因的大规模多重分析。Jou等人，Human Mutation5：86-93(1995)涉及使用所谓的“缺口连接酶链式反应”方法来同时扩增多个外显子的选定区域，其扩增产物在具有针对每个外显子的探针上的不同半抗原的特异性抗体的免疫色谱条带上进行阅读。