[发明专利]使用膨胀床色谱从植物中捕获病毒样颗粒的方法

说明书

发明领域

本发明涉及从混合物中对目的颗粒——如病毒样颗粒（例如，重组表达的自装配VLP）的捕获。本发明能够对目的颗粒进行有效捕获，并可扩大规模到商业规模用途的大体积。

前言

基因工程革命已扩展到开发可进行多种应用的重组蛋白质，包括人类及动物治疗剂。美国FDA批准了大约超过100种生物技术来源的治疗剂及疫苗用于医疗用途，此外，有超过1000种其他药物和疫苗正进行不同阶段的临床试验。目前，细菌、酵母、昆虫、植物和哺乳动物细胞表达系统用于生产重组蛋白质有不同的成功程度。尽管技术上的此项发展掀起了一场药物和治疗产品的生产和传递上的革命，但在对可获得的分子的纯化方面还存在问题。例如，纯化来自细菌的蛋白质要求裂解细胞，这可能需要数个步骤以及溶液澄清。这样，纯化过程中使用的色谱树脂会容易结块，于是细胞提取物可能需要通过其他过程进行进一步澄清——如通过离心或过滤。还可能需要多阶段的纯化过程，这会花费时间且还会导致样品的丢失及降低产出。目的蛋白质的纯化过程可能很昂贵，而且面临技术挑战。下游的加工可占据整个成本的高达80%。

在蛋白质的纯化中广泛采用填充床吸附色谱。使用填充床需要移除整个细胞或胶质碎片。碎片的移除在实验室规模过程的开发中常常受到忽视，但其却是达到高效率的最挑战的操作之一。膨胀床吸附是近期发展的方法，可用于纯化可溶性蛋白质，对加工流的澄清过程要求不高。其使液体流穿起始的填充床结构以接触高的流体空隙。

病毒样颗粒（VLP）是用于生产重组蛋白质，尤其是免疫原性重组蛋白质如免疫原性病毒重组蛋白质的一个手段。许多病毒具有的衣壳可由单独表达的结构蛋白质组装而成，组装过程可以在体内在形成VLP的过程中表达结构蛋白质和重组蛋白质的细胞内进行，也可在分离和纯化后在细胞外部进行。然而，在含有高含量悬浮固体和不同大小的颗粒的混合物中要捕获这些VLP在技术上非常具有挑战性，这通常是在涉及植物来源材料的情况下。当将VLP注射入动物以诱导产生阻断感染的抗病毒抗体时，VLP可能是免疫原性的。因此，例如以用来自H5N1禽流感菌株的蛋白质产生的病毒样颗粒免疫的小鼠可在以致死性H5N1病毒攻击时得到保护。

在工业上仍然需要一种方法用于以提高的效率和产率捕获目的颗粒。还需要一种可规模化用于商业水平的方法用于以成本有效的形式捕获颗粒。

发明概述

本发明至少部分地基于此项发现：膨胀床吸附（EBA）色谱对从混合物中捕获目的颗粒尤其有效。特定实施方式中，此方法可有利地用于在一步结合及洗脱过程中捕获目的颗粒，这可规模化到商业水平。

在一个一般方面，提供了用于从混合物中捕获目的颗粒的方法，其包括使用吸附剂膨胀床。

在一个实施方式中，所述方法包括步骤：(a)提供吸附剂的膨胀床；（b）将混合物与吸附剂相接触，使混合物的成分与吸附剂的膨胀床接触并相互作用；(c)可选地，洗涤吸附剂；以及（d）可选地，从吸附剂中洗脱目的颗粒。

在一个实施方式或上述实施方式的组合中，目的颗粒是目的生物学颗粒。

在一个实施方式或上述实施方式的组合中，目的颗粒包含至少一种蛋白质。

在一个实施方式或上述实施方式的组合中，目的颗粒包含至少两种蛋白质，其中至少一种是目的蛋白质。

在一个实施方式或上述实施方式的组合中，目的颗粒是病毒样颗粒。

在本发明的第一个方面，提供了用于从混合物中捕获病毒样颗粒的方法，其包括使用吸附剂膨胀床，合适地，其中所述方法包括步骤：(a)提供吸附剂的膨胀床；（b）将混合物与吸附剂相接触，使混合物中的病毒样颗粒与吸附剂结合；（c）可选地，洗涤吸附剂；以及（d）可选地，从吸附剂中洗脱目的颗粒。

在所述第一方面的一个实施方式中，本发明进一步涉及根据前述实施方式或上述实施方式的组合的方法，其中所述病毒样颗粒包含流感病毒的蛋白质，特别是血凝素；合适地，其为选自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16的血凝素亚型或其中两种或更多种的组合。

在包括所述第一方面的实施方式的一个实施方式或上述更实施方式的组合中，吸附剂包含在柱子当中。

在包括所述第一方面的实施方式的一个实施方式或上述实施方式的组合中，混合物为植物，或来源于植物。

在包括所述第一方面的实施方式的一个实施方式或上述实施方式的组合中，所述植物是天然发生的植物、突变体植物、非天然发生的植物或转基因植物。