[发明专利]胚胎干细胞来源的心肌细胞以及包含所述心肌细胞作为活性成分的细胞治疗剂

说明书

技术领域

本发明涉及胚胎干细胞来源的心肌细胞和包含所述心肌细胞作为活性成分的细胞治疗剂。更具体地，本发明涉及产生胚胎干细胞来源的心肌细胞的方法、由所述方法产生的心肌细胞、由所述心肌细胞产生心肌细胞体的方法、由所述方法产生的心肌细胞体、包含所述心肌细胞体作为活性成分用于治疗心脏病的细胞治疗剂以及使用所述细胞治疗剂治疗心脏病的方法。

背景技术

胚胎干细胞（ESC）来源的心肌细胞（CM）可以用于心血管疾病的再生疗法，因此许多研究人员已经开发出了多种使CM分化并分离CM的技术。但是，这些方法在其实际应用中遇到了由于CM产率低所带来的困难。已通过显微切割从收缩性人胚状体（hEB）中分离出CM。已知hEB的形成会诱导未分化的hESC形成收缩性CM，但是通过这种方法形成CM还有一些缺点。首先，在三维培养中，hEB不会表现出三个胚层所特有的分裂模式。第二，分化的细胞与不同细胞谱系的细胞相混。第三，难以分离出高浓度的CM。因此，许多研究人员已经尝试着通过机械分离、Percoll密度梯度分离并通过使用KDR、CD15和CD16来分离大量的CM。

但是，通过这些方法不能完全地分离出纯的CM细胞，因此在其临床应用中依然有缺陷。由于缺乏CM特异的表面标志物，也难以将常规培养方法应用于CM分离中。为了克服这些问题，使用重组慢病毒载体系统通过转导产生了MLC-2v诱导的表达GFP的hESC，并通过FACS分离将hESC用于从hEB分离CM。但是，由于病毒DNA能够整合至hEB的DNA中，hESC的这一临床应用大受局限。另外，通过显微切割从收缩性hEB分离CM具有这样一个问题，即由于其与内胚层细胞而非外胚层细胞可以共存的这一特征，CM与其他内胚层谱系细胞相混，目前正在积极地进行多项研究来解决这一问题。

另一方面，同样重要的一个因素是获得足量的CM来用作心血管疾病的治疗剂，因为成熟的CM具有有限的增殖活力。对于这一研究，已经开发出了使用生长因子或者END-2共培养体系（其中内胚层细胞系提供CM增殖和分化）的多种分化方法。但是，由于要使用生长因子，这一方法花费昂贵，并且还有从与其共培养的END-2细胞进一步分离CM的不便。因此，需要能够为针对心脏病的基于细胞的疗法提供高效高产率的产生和分离CM的方法。

发明内容

技术问题

在这一背景下，本发明人经过诸多努力，开发出了高效高产率纯化ESC分化的心肌细胞的方法。因此，他们开发出了使用无血清培养基纯化ESC分化的心肌细胞的方法，并发现拟用于治疗心脏病的心肌细胞体（CB）可以通过在无血清培养基中悬浮培养经纯化的CM来产生，由此完成了本发明。

技术方案

本发明的一个目的是提供由胚胎干细胞产生心肌细胞的方法，包括：（a）培养胚胎干细胞，以获得培养物；并（b）在无血清培养基中培养所述培养物，以纯化心肌细胞。

本发明的另一个目的是提供通过所述方法产生的心肌细胞。

本发明的又一个目的是提供产生心肌细胞体的方法，包括：（a）培养胚胎干细胞，以获得培养物；（b）在无血清培养基中培养所述培养物，以纯化成心肌细胞；并（c）在无血清培养基中培养所述经纯化的成心肌细胞。

本发明的另一个目的是提供通过所述方法产生的心肌细胞体。

本发明的另一个目的是提供用于治疗心脏病的细胞治疗剂，其包含作为活性成分的所述心肌细胞体。

本发明的另一个目的是提供治疗心脏病的方法，其包括将所述细胞治疗剂给予个体的步骤。

有益效果

本发明的产生心肌细胞的方法可用于容易地纯化胚胎干细胞分化的心肌细胞，无需另外的设备。另外，经纯化的心肌细胞可用于产生心肌细胞体，其可用作用于治疗心脏病的细胞治疗剂。因此，可以将心肌细胞体广泛地应用于开发针对心脏病的预防剂或治疗剂。

附图说明

图1至4：对来源于人胚胎干细胞的收缩性EB的细胞组分分析。

(图1,左图)当在含有20%FBS的DMEM培养基中悬浮培养15天时，出现了来源于人胚胎干细胞的分化的收缩性EB。

(图1,中图)表达CM特异的标志物cTnT的细胞以团块形式(clump)部分地位于收缩性EB中。

(图1,右图)第二幅图中的白色方框的放大图。

(图2,左图)在0.1%明胶包被的平板上分离收缩性和非收缩性区域，之后将收缩性EB铺板。

(图2,中图和右图)收缩性细胞簇区域中的细胞表达CM特异的标志物cTnT和sMHC。