[发明专利]化学增强型引物组合物、方法和试剂盒

说明书

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2010年10月28日提交的美国专利申请号61/407,899和2010年10月29日提交的专利申请号61/408,553的优先权权益，上述专利申请以引用的方式并入本文。

领域

本发明教义涉及化学修饰的寡核苷酸序列引物组合物和用于对DNA测序和片段分析的方法。本教义也涉及用于核酸(例如cDNA和DNA)的制备、片段分析和测序的组合物。

背景

标准聚合酶链式反应(PCR)/测序流程一般包括需添加试剂的五个步骤：初始PCR步骤、PCR清除步骤、测序步骤、测序清除步骤和电泳。PCR步骤涉及使用扩增引物和热稳定性DNA聚合酶扩增模板多核苷酸。PCR清除步骤常通过添加核酸外切酶I和碱性磷酸酶，然后孵育，随后热失活以使酶失活来进行。图1A中示出了标准PCR/测序流程。

典型PCR反应使用过量扩增引物，一些引物在PCR反应完成后仍未并入。这就需要先移除过量引物，然后进行测序反应，因为过量扩增引物将干扰随后的测序反应。PCR反应另外含有可干扰随后测序反应的过量dNTP。降解PCR混合物中存在的单链DNA的核酸外切酶I的水解性使扩增产物(扩增子)更有效地用于随后的测序应用。碱性磷酸酶的酶活性使PCR反应后所留下的游离dNTP脱磷酸。适当的孵育期后，使核酸外切酶I和碱性磷酸酶热失活，然后添加测序引物、dNTP和染料-标记的ddNTP；否则这些酶将降解这些试剂和测序反应产物。

没有足量核酸外切酶I的处理来移除过量PCR扩增引物，可产生异常的序列梯。过量dNTP可产生微弱的测序信号和/或短序列读数。需要由测序引物获得一个碱基的高质量序列结果通常也是困难的。从扩增到有效测序的过度得到了高质量5'序列分辨率并提前清除了未并入的dNTP和扩增引物以获得清晰的测序结果。

不牺牲使用POP7^TM聚合物的电泳过程中的通量停留时间(throughput residence time)，难以分辨测序引物附近的核酸序列。调整流动体系的类型，例如，使用POP6^TM聚合物基质，调整变性条件和温度可改善分辨率，但常以增加电泳时间为代价，因为POP6聚合物需要更长的电泳时间。移除未并入的反应物的困难以及进行尺寸依赖性流动性分离(size-dependent mobility separation)时的长停留时间导致核酸测序的无效。存在对用于PCR/测序和PCR/片段分析流程以及PCR扩增后序列分辨率的改善方法的需求。

发明概要

根据多个实施方案，本发明教义提供了一种化学增强型引物的组合物。根据多个实施方案，所述引物可包含带负电荷部分、寡核苷酸序列和耐核酸酶键。在多个实施方案中，所述引物可用于片段分析、对核酸测序和改善分辨率、通过使用POP-7^TM聚合物在毛细管电泳仪器(例如，由Applied Biosystems(Foster City,CA)制造的那些仪器)上进行的测序流程的PCR。

根据多个实施方案，本发明教义提供了一种用于对核酸测序的组合物。根据多个实施方案，所述组合物可包括一种组合物，其包含含有寡核苷酸序列、带负电荷部分(NCM)和至少一个耐核酸酶键的化学增强型引物。在多个实施方案中，组合物可另外包含聚合酶、核酸酶、脱氧三磷酸核苷(dNTP)和双脱氧三磷酸核苷(ddNTP)以及至少一种染料-标记。在本方法的多个实施方案中，可一步式将组合物直接加入PCR反应产物中，而无需先首先从PCR反应产物中移除过量PCR扩增引物。

根据多个实施方案，本发明教义涉及制备用于测序的DNA的方法，对DNA测序的方法，以及用于对DNA测序的组合物。本发明教义提供了一种PCR/测序(包括循环测序)的方法，该方法与传统方法相比，可以更快速且更简易，并且需要更少的步骤。本发明教义的方法利用化学增强型引物结合核酸酶，可降低序列噪声并移除非所需的序列引发(sequence priming)。本发明教义另外提供了一种所述方法可使用的用于DNA测序的组合物。

根据多个实施方案，本发明教义公开了一种制备用于测序的DNA的方法。在一些实施方案中，该DNA制备方法可免去常规PCR/循环测序中使用的至少一个试剂添加步骤，因此减少了处理步骤的数量。