[发明专利]用于在真菌细胞中表达基因的启动子

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求于2010年12月16日提交的美国临时申请序列号第61/423,909号的权益，该申请并入本文以作参考。

对序列表的引用

本申请包含计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式并入本文以作参考。

技术领域

本发明涉及生产多肽的方法。本发明还涉及分离的启动子以及包含与编码多肽的多核苷酸可操作地连接（operably linked）的启动子的核酸构建体（construct）、载体和宿主细胞。

背景技术

多肽在真菌宿主细胞例如丝状真菌细胞中的重组生产，可以提供更合乎需要的载体用于以商业相关的量生产多肽。

通过构建表达盒而完成多肽的重组生产，在表达盒中，编码多肽的DNA处于从基因上分离的适用于宿主细胞的启动子的表达控制下。通常通过质粒介导的转化将表达盒引入宿主细胞中。之后通过在对于表达盒中所包含的启动子的适当运作有必要的诱导条件下，培养被转化的宿主细胞，从而实现多肽的生产。

真菌宿主细胞在重组生产多肽中的使用，通常需要适合于在宿主细胞中控制多肽表达的启动子的可用性。因此，领域内需要新的启动子来控制基因的重组表达。

本发明提供改善的用于在真菌宿主细胞中生产多肽的方法。

发明内容

本发明涉及用于生产多肽的方法，包括：（a），在有益于生产多肽的介质中培养真菌宿主细胞，其中真菌宿主细胞包括与选自以下的启动子可操作地连接的编码多肽的多核苷酸，所述启动子选自（i）包括与SEQ ID NO：1具有至少60%序列一致性的核苷酸序列的启动子，（ii）包括在至少中等严格条件下与SEQ ID NO：1或其全长互补链杂交的核苷酸序列的启动子，（iii）包括SEQ ID NO：1的启动子，（iv）包括（i）、（ii）或（iii）的子序列并保持启动子活性的启动子，以及（v），（i）、（ii）、（iii）或（iv）的突变、杂合或串联启动子，其中编码多肽的多核苷酸对于启动子是外源的；以及（b），从培养介质中分离多肽。

本发明还涉及选自以下的分离的启动子：（i）包括与SEQ ID NO：1具有至少60%序列一致性的核苷酸序列的启动子；（ii）包括在至少中等严格条件下与SEQ ID NO：1或其全长互补链杂交的核苷酸序列的启动子；（iii）包括SEQ ID NO：1的启动子；（iv）包括（i）、（ii）或（iii）的子序列并保持启动子活性的启动子；以及（v），（i）、（ii）、（iii）或（iv）的突变、杂合或串联启动子。

本发明还涉及构建体、载体和真菌宿主细胞，其包含与编码多肽的多核苷酸可操作地连接的本发明启动子。

附图说明

图1示出pSMai226的限制性图谱。

图2示出pSaMe-CatP的限制性图谱。

图3示出里氏木霉（Trichoderma reesei）过氧化氢酶启动子的DNA序列（SEQ ID NO：1）。

具体实施方式

定义

等位变体（allelic variant）：术语“等位变体”是指占据相同染色体基因座的两种或多种（例如，数种）可替换基因形式中的任一种。等位变体自然地通过突变而产生，且可以引起群体内的多态性。基因突变可以是沉默的（在编码的多肽中没有变化），或者可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。

cDNA：术语“cDNA”是指能够通过得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子的反转录而制得的DNA分子。cDNA缺少可能存在于相应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录子是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤加工，包括剪接。

编码序列：术语“编码序列”是指多核苷酸，其直接明确多肽的氨基酸序列。编码序列的边界通常由开放阅读框决定，其以起始密码子例如ATG、GTG或TTG开始，并以终止密码子例如TAA、TAG或TGA结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。