[发明专利]红曲霉在有机酸生产中的用途

说明书

发明领域

本发明涉及用于生产有机酸的微生物及其应用。

发明背景

有机酸广泛用于食品、药品和纺织工业，被公认为生物炼制中的关键化学构建块之一。将有机酸用于生产用作可生物降解塑料的多聚体也是人们感兴趣的。

许多微生物都能够通过有氧或厌氧发酵过程来生产有机酸。乳酸杆菌物种目前被广泛用于以淀粉为基础的乳酸生产工业。这些物种中大多数都缺乏发酵戊糖，比如木糖和阿拉伯糖，的能力。尽管戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）、短乳杆菌（Lactobacillus brevis）和乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）能够将戊糖发酵为乳酸，但戊糖是经磷酸酮醇酶途径代谢的，该途径的乳酸生产效率低下。事实上，在磷酸酮醇酶途径中，5-磷酸木酮糖被切割为3-磷酸甘油醛和乙酰磷酸。经该途径，由于丢失两个碳原子给乙酸，使得乳酸的最大理论产率限于一乳酸每戊糖（0.6g乳酸每克木糖）。

在大多数比如大肠杆菌这样的平台宿主生物中，高滴度的有机酸生产要么是低效率的要么是有毒性的。在中性pH生产比如乳酸这样的有机酸通常导致产生乳酸钙，不得不通过添加硫酸使其转化成乳酸，结果形成CaSO₄（石膏）作为副产物。为了直接生产乳酸，必须在低pH（优选比乳酸的pKa值3.85至少低一个单位）下完成发酵。然而乳酸对微生物是有毒性的，因为在其质子化形式下，它是破坏膜电势的解偶联剂。因此，尽管有许多微生物能够耐受低pH，却只有有限的微生物因能在低pH耐受有机酸而适于有机酸生产。

细菌发酵的一个重要缺陷是成本。由于许多细菌不能合成为其生长和有效代谢糖类所需的某些氨基酸或蛋白质，因而常需向细菌饲以稍显复杂的营养包，这提高了进行发酵的直接开支。此外，液体培养基的复杂性提高也使得回收合理纯度形式的发酵产物更加困难，由此使得回收产物操作和资金成本提高。还有，使用玉米作为给料直接与食品和饲料业形成竞争。

由此，仍然需要用于乳酸发酵工艺的改良生物催化剂。

发明概述

本发明提供用于有机酸生产的改良微生物。更特别的是，本发明提供在低pH高度耐受高浓度有机酸并因此而适用于通过遗传工程生产有机酸的微生物。在更特别的实施方案中，本发明提供重组真菌，更特别的是红曲霉属内物种的重组真菌，所述重组真菌中特定外源和/或内源基因过表达和/或被抑制由此使其在发酵培养基中培养时可产生更高水平的有机酸。相应地，本发明的重组红曲霉菌株可用于在低pH提高有机酸生产并由此而提供更大量的食品和工业应用有机酸供应。

因此本发明第一方面提供微生物，更特别的是，红曲霉属的微生物，其能够在低pH耐受高浓度的有机酸。在特别的实施方案中，它们可以在高于有机酸pKa值不到1.5个单位的pH耐受浓度提高的有机酸。更特别的是，本发明的微生物可在低于5，更特别的是低于4，甚至更特别的是低于3，最特别的是低于2.8的pH耐受比如乳酸这样的有机酸。在更特别的实施方案中，它们能够在含有50g/L，最特别的是100g/L有机酸的培养基中生长，以及在具体的实施方案中在含有高达150至175g/L有机酸的培养基中，在低pH，更特别的是低于5，更特别的是低于4，甚至更特别的是低于3，最特别的是低于2.8的pH生长。在本发明的具体实施方案中，红曲霉属内的种是红色红曲霉（Monascus rubber）。该高酸耐受性使它们，甚至在厌氧或准厌氧条件下，尤其适用于有机酸的工业生产。

在具体实施方案中，为进一步增强有机酸生产，这些微生物经遗传工程修饰。在具体实施方案中，本发明的微生物能够在己糖和戊糖中生长并在有机酸中转化这些糖。在更特别的实施方案中，本发明的微生物在浓度为至少50g/L，更特别的是，浓度为至少70g/L，至少100g/L，至少200g/L或更高的葡萄糖和木糖中生长。在某些特定的实施方案中，本发明提供能够在低pH下生产更高水平乳酸，尤其是L-乳酸，的经遗传修饰或重组的红曲霉菌株。更特别的是，L-乳酸是以高产率从己糖和/或戊糖生产的。

在具体实施方案中，根据本发明的微生物包含异源或外源LDH基因。相应地，在具体实施方案中，本发明提供包含异源或外源LDH基因的经遗传修饰或重组的红曲霉菌株。在进一步的特定实施方案中，根据本发明的经遗传修饰或重组的红曲霉菌株包含异源或外源LDH基因，其编码与由SEQ ID NO:1编码的蛋白质有至少80%同一性的功能性蛋白质。