[发明专利]具有表面蛋白简化糖基化的病毒颗粒的生产方法

权利要求书

1.一种用于生产单糖基化流感病毒的方法，所述方法包括：

a)在具有有效量甘露糖苷酶抑制剂的适合宿主中培养流感病毒血凝素(HA)抗原，其中所述甘露糖苷酶抑制剂的浓度足以抑制N-糖基化途径中的α-甘露糖苷酶I，和

b)回收流感病毒HA抗原并接触内切糖苷酶(Endo H)，其中Endo H的浓度足以除去高甘露糖型聚糖，和

c)分离单糖基化流感病毒HA抗原。

2.根据权利要求1的方法，其中所述HA抗原源自高致病性H5N1流感病毒。

3.根据权利要求2的方法，其中所述高致病性H5N1流感病毒是NIBRG-14。

4.根据权利要求1的方法，其中所述甘露糖苷酶抑制剂是基夫碱(Kif)。

5.根据权利要求1的方法，其中所述甘露糖苷酶抑制剂是脱氧甘露糖野尻霉素(DMJ)。

6.根据权利要求1的方法，其中所述流感HA抗原是在细胞培养物中重组生产的。

7.根据权利要求7的方法，其中所述细胞培养物包括MDCK细胞、Vero细胞或PER.C6细胞。

8.根据权利要求1的方法，其中α-甘露糖苷酶I的抑制产生带有Man₉(GlcNAc)₂的糖蛋白。

9.根据权利要求1的方法，其中所述流感HA抗原包括完整流感病毒。

10.根据权利要求9的方法，其中所述完整流感病毒生长在无特异病原的(SPF)含胚鸡蛋宿主中。

11.根据权利要求10的方法，其中向无特异病原的(SPF)含胚鸡蛋的尿囊腔中添加基夫碱。

12.根据权利要求6的方法，其中向带有重组流感HA抗原的宿主细胞添加基夫碱。

13.根据权利要求11或12的方法，其中以0.005至0.5mg/ml的浓度添加基夫碱。

14.根据权利要求6的方法，其中回收流感HA抗原包括从所述宿主细胞分离所述重组生产的流感HA抗原。

15.根据权利要求10的方法，其中回收流感HA抗原包括：

孵育足以生长所述流感病毒的时间；然后

分离包含所述流感病毒的尿囊液。

16.根据权利要求14或15的方法，其中使用约0.1至约100μg/mL Endo H处理所回收的流感病毒HA抗原。

17.根据权利要求15的方法，其中通过包括密度梯度超速离心的方法分离所述单糖基化流感病毒。

18.根据权利要求1的方法，其还包括通过包括超滤的方法纯化所述单糖基化流感病毒HA抗原。

19.根据权利要求18的方法，其中所述超滤包括使用0.2μm滤器。

20.根据权利要求1的方法，其还包括通过电子显微镜分析所述单糖基化流感病毒。

21.根据权利要求1的方法，其还包括通过包括PNGase处理的方法量化所述单糖基化流感病毒。

22.根据权利要求1的方法，其还包括通过包括SDS-PAGE电层析的方法量化所述单糖基化流感病毒。

23.根据权利要求1的方法，其还包括通过包括质谱的方法分析所述分离的单糖基化流感病毒的聚糖组成。

24.根据权利要求1-23中任一项的方法，其中所述流感病毒HA抗原选自单糖基化流感病毒HI、H3和H5糖蛋白组成的组。

25.一种单糖基化流感病毒HA抗原(完整病毒或重组体)，其通过权利要求1-24的任一项方法制备。

26.一种通过权利要求1-24的任一项方法制备的单糖基化流感病毒HA抗原(完整病毒或重组体)用于制备疫苗的应用。