[发明专利]具有表面蛋白简化糖基化的病毒颗粒的生产方法

说明书

发明人：

齐晖·王，马澈和曾永杰

相关申请的交叉引用

本申请要求2010年11月4日提交的、标题为“单糖基化流感病毒血凝素的生产方法”的美国临时专利申请序列号No.61/410,257的优先权，其全部内容援引加入本申请。

技术领域

本发明涉及病毒且具体涉及具有简化聚糖(simplified glycans)的病毒颗粒的生产。具体地，本发明涉及具有简化糖基化的流感病毒颗粒的生产。具体地，本发明涉及单糖基化流感病毒颗粒的生产方法。

背景技术

本发明公开了单糖基化(mono-glycosylated)流感病毒的示例性制备。认为相同方法可用于制备具有简化聚糖结构的其他病毒，包括逆转录病毒(如人免疫缺陷病毒(HIV))和黄病毒（如登革病毒、西尼罗病毒、丙肝病毒(HCV)等）。

流感是由正粘病毒科的RNA病毒导致的。这些病毒有3种类型且它们导致3种不同类型的流感：A、B和C型流感。A型流感病毒感染哺乳动物(人、猪、雪貂、马)和禽类。由于此类病毒已导致世界范围的疾病大流行，其对人类非常重要。B型流感病毒(也简称做流感B)仅感染人类。其偶尔导致流感的局部爆发。C型流感病毒也仅感染人类。它们感染大多数年轻人且很少导致严重的疾病。

A型流感病毒感染种类繁多的哺乳动物，包括人、马、猪、雪貂和禽类。该主要的人类病原体与时疫和疾病大流行相关。有至少15种已知的血凝素(H)血清型和9种已知的神经氨酸酶(N)血清型。认为猪和禽类是特别重要的储存宿主，产生了在遗传和抗原性方面不同的病毒库，其通过人与动物之间的亲密接触而反向传播至人群。B型流感病毒仅感染哺乳动物且导致疾病，但通常不如A型严重。与A型流感病毒不同，B型流感病毒没有可区分的血清型。C型流感病毒也仅感染哺乳动物，但很少导致疾病。它们在遗传和形态学上不同于A型和B型。

流感病毒中存在4种抗原：血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核壳体(NA)、基质(M)和核壳体蛋白(NP)。NP是以A、B和C三种形式存在的类型特异性抗原，其提供了人流感病毒的分类基础。基质蛋白(M蛋白)环绕核壳体且构成35-45%的颗粒质量。在表面上观察到呈棒状突起的两种表面糖蛋白。血凝素(HA)首先合成为包含三条相同蛋白链的三聚前体(HA0)，其中每条蛋白链经蛋白水解加工成通过单个二硫键共价结合在一起的两个亚基HA1和HA2。HA介导病毒与细胞受体的附着。神经氨酸酶(NA)分子以较少的量存在于外壳中。流通的人类株因其常年累积突变并导致周期性时疫的趋势而众人皆知。

在真核生物中，糖残基通常与4种不同的氨基酸残基相连。这些氨基酸残基分类为O-连接(丝氨酸、苏氨酸和羟赖氨酸)和N-连接(天冬酰胺)。O-连接糖在高尔基体或粗内质网(ER)从核苷酸糖合成而来。N-连接糖由常见前体合成，随后进行加工。已知N-连接糖链的添加对于稳定折叠、预防内质网中的降解、寡聚化、生物活性和糖蛋白的运输具有重要意义。向特定的Asn残基添加N-连接的寡糖在调控病毒成熟蛋白的活性、稳定性或抗原性中发挥重要作用(Opdenakker G.等人FASEB Journal7,1330-13371993)。现在也已提出N-连接的糖基化是折叠、运输、细胞表面表达、糖蛋白分泌(Helenius,A.,Molecular Biology of the Cell5,253-2651994)、防止蛋白降解和增强糖蛋白溶解性(Doms等人,Virology193,545-5621993)所需的。病毒表面糖蛋白不仅是正确的蛋白折叠所需的，而且还提供了对抗中和抗体的“聚糖防御物”的保护作用。因此，强宿主特异性选择经常与潜在N-连接糖基化的密码子位置相关。因此，N-连接糖基化位点在株间和进化枝之间趋于保守。

A型流感病毒暴发不断在全世界导致普遍的发病和死亡。仅在美国，估计每年有5-20%的人口被A型流感病毒感染，导致约200,000例住院治疗和36,000例死亡。全面免疫政策的建立已成为限制流感发病率的有效方法。然而，病毒的频繁遗传漂变需要每年重新配制疫苗，潜在地造成疫苗中存在的病毒株与流行的病毒株之间的不匹配。因此，抗流感病毒的抗病毒疗法是限制疾病严重性和传播的重要工具。