[发明专利]用寡核苷酸靶向改变DNA

权利要求书

1.一种靶向改变包含第一DNA序列和与所述第一DNA序列互补的第二DNA序列的双链受体DNA序列的方法，所述方法包括：

将所述双链受体DNA序列与至少第一寡核苷酸和第二寡核苷酸组合，

其中，所述第一寡核苷酸包含能够与所述第一DNA序列杂交的至少一个结构域，并且所述第一寡核苷酸还包含相对于所述第一DNA序列的至少一个错配，所述至少一个错配位于距离所述第一寡核苷酸3’末端最多2个核苷酸处；

其中，所述第二寡核苷酸包含能够与所述第二DNA序列杂交的至少一个结构域，并且所述第二寡核苷酸还包含相对于所述第二DNA序列的至少一个错配，所述至少一个错配位于距离所述第二寡核苷酸3’末端最多2个核苷酸处；

所述在第一寡核苷酸中的至少一个错配相对于所述双链受体DNA序列的所述第一DNA序列，而所述在第二寡核苷酸中的至少一个错配相对于所述双链受体DNA序列的所述第二DNA序列，其中所述核苷酸占据了所述双链受体DNA中的互补位点。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一寡核苷酸中的错配或所述第二寡核苷酸中的错配独立地位于距离所述寡核苷酸3’末端最多1个核苷酸处，更优选地，所述至少一个错配位于所述寡核苷酸的3’末端，优选地，两条寡核苷酸中的所述错配都位于所述寡核苷酸的3’末端。

3.如前述的任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述在第一寡核苷酸和/或第二寡核苷酸中的所述结构域包含或直接相邻于所述至少一个错配。

4.如前述的任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述第一寡核苷酸除了所述错配以外与所述第一DNA序列互补且/或所述第二寡核苷酸除了所述错配以外与所述第二DNA序列互补。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述在第一寡核苷酸中的错配位于3’末端并且所述在第二寡核苷酸中的错配位于3’末端。

6.如前述的任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述第一寡核苷酸和/或第二寡核苷酸包含具有至少一个修饰的核苷酸的至少一个部分，其中所述修饰选自下组：碱基修饰、3’和/或5’末端碱基修饰、主链修饰或糖修饰。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述修饰的核苷酸选自下组：LNA或硫代磷酸酯键。

8.如权利要求6-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述寡核苷酸包含至少2、3、4、或5个修饰的核苷酸，优选所述寡核苷酸包含2、3、4或5个修饰的核苷酸。

9.如前述的任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述错配不是修饰的核苷酸。

10.如权利要求6-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述修饰的核苷酸距离所述至少一个错配至少1个核苷酸，所述错配位于距离所述寡核苷酸的3’末端最多2个，优选最多1个核苷酸处，最优选所述至少一个错配位于寡核苷酸的3’末端。

11.如前述的任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述双链受体DNA的改变优选地在选自下组的细胞中进行：原核细胞、细菌细胞、真核细胞、植物细胞、动物细胞、酵母细胞、真菌细胞、啮齿动物细胞、人细胞、非人细胞、和/或胚胎细胞。

12.如前述的任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述双链受体DNA从原核生物体、细菌、真核生物体、植物、动物、酵母、真菌、啮齿动物、或人中获得。

13.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述改变是缺失、替换和/或插入至少一个核苷酸。

14.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述双链受体DNA来自基因组DNA、线性DNA、人工染色体、哺乳动物人工染色体、细菌人工染色体、酵母人工染色体、植物人工染色体、核染色体DNA、细胞器DNA、和/或包括质粒的附加体DNA。

15.如前述的任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述方法用于改变细胞、通过野生型的恢复修正突变、诱导突变、通过破坏编码区使酶失活、通过改变编码区调节酶的生物活性、通过破坏编码区改变蛋白。