[发明专利]用寡核苷酸靶向改变DNA

说明书

技术领域

本发明涉及靶向改变受体DNA，例如双链受体DNA的方法。所述方法包括使用至少两条寡核苷酸，每条寡核苷酸具有至少一个相对靶（双链）受体DNA的错配。第一寡核苷酸的错配针对双链中第一条链的核苷酸，而第二寡核苷酸的错配针对与第一条链核苷酸形成碱基配对的第二条链的核苷酸。这些错配位于所述寡核苷酸的特定位点。本发明同时提供了包括用于实施本发明方法的说明书的试剂盒，在优选实施方式中该试剂盒包括适用于本方法的寡核苷酸。

背景技术

遗传修饰是在活细胞的遗传物质中特意制造改变的方法。通常目的是修饰细胞，或细胞形成部分的生物体或细胞可再生的生物体的遗传编码生物性质。这些改变可采用以下方式：删除部分遗传物质、添加外源遗传物质、或改变遗传物质中存在的核苷酸序列，例如用一个碱基取代另一个碱基。

20多年前已经知道遗传修饰真核生物的方法，并发现已广泛应用于植物、人和动物细胞和微生物以改善农业、人类健康、食物品质和环境保护领域。

常见的遗传修饰方法由以下步骤组成：向细胞基因组添加外源DNA片段，这可以赋予该细胞或生物体一种新特性，该性质超过并优于已存在基因编码的特性（包括从而抑制已存在基因表达的应用）。

虽然这些方法可能在向靶标提供需要的性质有一定功效，但是这些方法不是很精确。例如，无法控制外源DNA片段插入的基因组位置（进而控制最终表达水平）。另外，所需效果的自身体现必须超过原始和良好平衡基因组所编码的天然性质。相反，导致预定基因组基因座中核苷酸的增加、缺失或转化的遗传修饰的方法能够精确并可控地修饰现有基因。

寡核苷酸介导的靶向核苷酸交换（TNE）是一种基于向真核细胞递送（合成）寡核苷酸（由短延伸段核苷酸段和/或类似DNA的沃森克里克碱基配对性质，但是化学上与DNA不同的核苷酸部分组成的分子；（Alexeev和Yoon，1998）；（Rice等，2001）；（Kmiec，2003））的方法。

通过在寡核苷酸的同源序列上特意设计错配核苷酸，该错配核苷酸可能诱导改变该核苷酸杂交的基因组DNA序列。这个方法允许转化靶标中一个或多个核苷酸，并且可能，例如，应用于现有基因中以产生终止密码子，导致它们功能的破坏，或者产生密码子改变，导致基因编码的蛋白质具有改变的氨基酸组成（蛋白质工程）。

靶向核苷酸交换（TNE）已经在包括植物、动物和酵母细胞的许多生物体中描述，也称为寡核苷酸诱变（ODM）。

TNE的第一批例子使用来自动物细胞的嵌合DNA：RNA寡核苷酸（参见（Igoucheva等，2001））。使用嵌合DNA：RNA寡核苷酸的TNE也在植物细胞中证明（Beetham等，1999；Kochevenko和Willmitzer，2003；Okuzaki和Toriyama，2004；Zhu等，2000；Zhu等，1999）。通常，在非选择性染色体基因座上实际应用TNE时，植物和动物研究中报告的频率都太低。发现使用嵌合寡核苷酸的TNE也难以重复（Ruiter等，2003），从而需要寻找其它寡核苷酸设计以产生更可靠的结果。

多个实验室已聚焦于在TNE中使用单链（ss）寡核苷酸上。已发现其在植物和动物细胞中提供了更多可重复的结果（Liu等，2002）（Parekh-Olmedo等，2005）（Dong等，2006）。然而，在细胞，具体是较高等生物体（如植物）的细胞中使用TNE所面临的最大问题还是迄今为止报道的相对低的效率。在玉米中，报道的转化频率为1x10^-4（Zhu等，2000）。在烟草（Kochevenko和Willmitzer，2003）和水稻（Okuzaki和Toriyama，2004）中的后续实验中报道的频率分别是1x10^-6和1x10^-4。

使用各种类型寡核苷酸的TNE已经是一些专利和专利申请的主题，包括US6936467、US7226785、US579597、US6136601、US2003/0163849、US2003/0236208、WO03/013226、US5594121和WO01/92512。

在US6936467中认为，使用未修饰的DNA寡核苷酸得到低基因改变频率是在反应混合物或靶细胞中存在的核酸酶降解了供体寡核苷酸的结果。提出引入修饰的核苷酸，其使所得的寡核苷酸（更）耐受核酸酶。公开了这些修饰优选位于寡核苷酸末端，其中错配存在于距离各末端至少8个核苷酸。