[发明专利]核酸样品的制备方法及组合物

说明书

本申请要求于2010年12月27日提交的美国临时申请序号61/427,321的优先权，其全部通过引用结合到本文中。

发明领域

本发明提供了用于在通用缓冲液中制备核酸文库(例如，应用全基因组扩增)的组合物和方法，其中在步骤之间或步骤期间不需要核酸的纯化。在某些实施方案中，应用少量起始核酸(例如，基因组DNA)并且所述步骤在单一容器中完成。在一些实施方案中，可对所述核酸文库进行测序方法或滚环扩增。

背景

在例如基因诊断、癌症研究或法医学等许多研究领域中，基因组DNA的不足对可在样品上进行的基因试验的类型和数量而言可是严重的限制性因素。设计以克服该问题的一个方法是全基因组扩增。目标是以非特异性的方式扩增有限的DNA样品以产生与原始样品无区别但具有更高DNA浓度的新样品。典型的全基因组扩增技术的目的是在遵守原始序列表征的同时将样品扩增至微克水平。

首个全基因组扩增方法描述于1992年，并且是基于聚合酶链式反应的原理。Zhang及同事(Zhang, L.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89: 5847-5851；通过引用结合到本文中)开发了引物延伸PCR技术(PEP)以及Telenius和合作者(Telenius等, Genomics. 1992, 13(3):718-25；通过引用结合到本文中)设计了简并寡核苷酸引物PCR法(DOP-PCR)。

PEP涉及高数目的PCR循环，其通常利用Taq聚合酶和在低的严格性温度下退火的15个碱基的随机引物。虽然已以不同的方式改善PEP方案，但其仍导致不完全的基因组覆盖度，未能扩增某些序列例如重复序列。未能启动并扩增包含重复序列的区域可导致全基因组的不完全表征，因为横穿基因组长度的稳定的引物覆盖度提供了基因组的最佳表征。该方法对非常少的样品(如单个细胞)也有有限的效率。此外，Taq聚合酶的使用意味着最大的产物长度为约3 kb。

DOP-PCR为通常用Taq聚合酶和半简并寡核苷酸(例如CGACTCGAGNNNNNNATGTGG (SEQ ID NO: 12)，例如其中N =A、T、C或G)的方法，所述寡核苷酸在低退火温度下结合人基因组内约一百万个位点。在第一循环后用较高退火温度进行大量循环，其仅允许在第一步骤中标记的片段扩增。这导致全基因组的不完全表征。与PEP相似，DOP-PCR产生平均400-500 bp、最大长度3 kb的片段，尽管已报道产生长达10 kb的片段。另一方面，如对PEP所指出，基因组DNA的低输入(少于1 ng)降低了保真度和基因组覆盖度(Kittler等, Anal. Biochem. 2002, 300(2), 237-44)。

多重置换扩增(MDA，亦称为链置换扩增；SDA)是基于随机六聚体对变性DNA的退火而不基于PCR的等温方法，随后在恒定温度下进行链置换合成(Blanco等, 1989, J. Biol. Chem. 264:8935-40，通过引用结合到本文中)。其已适用于少量的基因组DNA样品，导致具有有限的序列表征偏好的高分子量DNA的合成(Lizardi等, Nature Genetics 1998, 19, 225-232；Dean等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2002, 99, 5261-5266；这两者通过引用结合到本文中)。随着DNA通过链置换合成，逐渐增加的许多启动事件发生，形成超分支DNA结构的网络。所述反应可通过Phi29 DNA聚合酶或通过大片段的Bst DNA聚合酶催化。Phi29 DNA聚合酶具有比Taq聚合酶导致的错误率低至1/100的校对活性。

所需要的是在步骤之间或步骤期间不需要核酸纯化，和/或可在单一容器中完成的全基因组扩增方法。

发明简述

本发明提供了用于在通用缓冲液中制备核酸文库(例如DNA文库) (例如应用全基因组扩增，例如MDA)的组合物和方法，其中在步骤之间或步骤期间不需要核酸纯化。在某些实施方案中，应用少量起始核酸(例如，基因组DNA) (例如，皮克级或纳克级)并且所述步骤在单一容器中完成。在一些实施方案中，可对所述核酸文库进行测序方法或滚环扩增。