[发明专利]固定核配体的方法

说明书

发明领域

本发明涉及通过可在工业规模使用的亲和支持物纯化目标物质的领域，特别是用于获得具有医学目的的纯化物质。 

现有技术

经常需要能够选择性富集具有目标物质的起始产物的亲和层析支持物。在医学领域中，亲和层析支持物用于纯化之后用作药物活性成分的物质。主要使用其上固定了抗体的免疫亲和层析支持物。免疫亲和支持物适合用于在工业规模纯化具有医学目的的物质，因其具有良好的保留能力和对其靶分子的高选择性。在纯化过程结束时，可以再生这类免疫亲和支持物而基本不损失其保留能力或其选择性，从而使它们能够使用很长的时间。此外，由于其高保留能力，免疫亲和支持物使得能够纯化大量的靶物质，从而使其用途符合药物生产的技术和经济需求。然而，当用于纯化具有医学目的的物质时，免疫亲和支持物存在缺陷，特别是由于(i)在洗脱先前保留的靶物质的阶段，源自固定的抗体的免疫原性蛋白质片段的释放，和(ii)抗体对于洗脱条件以及周期性抗菌和抗病毒消毒处理的脆弱性。 

为了发现已知的免疫亲和支持物的备选物进行了多种研究。有限的研究关注了使用适配体作为亲和配体，用于纯化包括靶蛋白在内的靶物质。作为实例，可提及Romig等人的研究(J.Chromatogra.B Biomed Sci Appl，1999，731(2)：275-84)，该研究关注在层析支持物上纯化L-选择素，所述层析支持物上通过链霉亲和素-生物素配对已经固定了抗L-选择素DNA适配体。 

长期以来，已知适配体对其靶分子的亲和力和特异性可以与抗体一样高。此外，因为适配体可以通过化学合成获得，因此其生产成本明显低于 抗体。然而，即使适配体作为亲和配体表现出多种经济和技术优势，适配体亲和支持物用于纯化靶物质的用途目前仍是边缘的。就申请人已知的情况，目前还没有用于纯化包括靶蛋白在内的靶物质的工业方法包括基于使用适配体亲和支持物的步骤。 

一种可以解释在工业规模的纯化方法中缺少适配体应用的原因是难以获得在其上稳定且定量地附着适配体的亲和支持物。 

现有技术中描述的用于固定适配体的主要技术是基于使用生物素-链霉亲和素或生物素-抗生物素配对。该技术利用了生物素对其抗生物素或链霉亲和素配体的选择性和强亲和力，还利用了二者缔合获得的非共价复合物的稳定性。然而，由于所使用的偶联剂的蛋白质性质，和在支持物与适配体之间形成的键的非共价性质，导致该类亲和支持物存在技术局限性。实际上，生物素和抗生物素或链霉亲和素对能够诱导蛋白质变性的处理敏感。此外，生物素／链霉亲和素复合物在低温解离，特别是在非离子或低盐浓度的含水溶液中。出于上述多种原因，通过生物素／链霉亲和素复合物，在其上固定核适配体作为配体的亲和支持物不适合用于纯化方法，特别是工业纯化方法，对于工业纯化方法，亲和支持物能够在各个纯化周期中再生和消毒是关键性的。 

现有技术还描述了若干种用于将核酸共价移植至固体支持物上的技术，目的基本上是获得用于执行分析方法的新工具。因此，已描述了将具有反应性胺的核适配体移植至用溴化氰活化的琼脂糖支持物上(Madru等人，2009，Anal.Chem.，第81卷：7081-7086)。还描述了将高碘酸盐氧化的RNA适配体移植至用己二酸二酰肼基团活化的琼脂糖支持物上(Caputi等人，1999，The EMBO Journal，第18卷(14)：4060-4067)。通过双官能团偶联剂(如SIAB)移植核适配体的技术也是已知的(Rehder等人，Electrophoresis，第22卷(17)：3759)。 

现有技术还公开了用于在硅或琼脂糖类型的固体支持物上共价偶联核酸，尤其是适配体的技术，所述支持物包含预先用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化的羧基(Goss等人，1990，J Chromatogr，第508卷：279-287；Larson 等人，1992，Nucleic Acids research，第20卷(13)：3525；Allerson等人，2003，RNA，第9卷：364-374)。这些偶联技术由直接应用常用于在固体支持物上偶联蛋白质的技术组成。