[发明专利]一种制备多糖的新方法

权利要求书

1.一种具有成本效益、基于无酒精和CTAB的色谱的方法，用于从抗原性多糖中去除C-多糖，包括以下步骤：

(a)用脱氧胆酸盐裂解发酵培养基中的细菌细胞，产生包含多糖溶液和固体细胞碎片的裂解物；

(b)通过将固体与所述多糖溶液分离，使含水细胞裂解物澄清；

(c)用截留分子量为100K的膜进行超滤，浓缩所述多糖溶液，除去低分子量污染物以形成浓缩的多糖的溶液；

(d)用核酸酶对所述含有多糖的溶液进行处理；

(e)用硫酸铵或脱氧胆酸钠处理，沉淀杂质；

(f)用截留分子量为100K的膜进行透析；

(g)将多糖溶液进行单步或多步色谱；

(h)浓缩及透析；以及

(i)对纯化的多糖溶液进行无菌过滤。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述纯化的荚膜多糖中的类型特异性C-多糖污染物相对于所述离子交换色谱前或疏水作用色谱(HIC)后的C-多糖下降1-5倍，蛋白质污染物少于1%，且核酸污染物少于1%。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法比基于CTAB/酒精的方法需要至少少于80%的时间，及至少少于90%的成本。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，多糖抗原选自但不限于肺炎链球菌(S.pneumoniae)和无乳链球菌(S.agalactiae)。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述肺炎链球菌(S.pneumoniae)多糖抗原选自血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述单步或多步色谱能包含i)疏水作用后随离子交换、ii)直接离子交换和iii)离子交换后随HIC。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述疏水作用色谱支持物选自如下的组，包含丁基-、苯基-、辛基-琼脂糖、丁基-、醚-有机高分子树脂和苯基琼脂糖凝胶。

8.根据权利要求6所述的方法，其中，所述疏水作用色谱柱在pH5至8范围内运行，优选地为6至7.6。

9.根据权利要求6所述的方法，其中，所述疏水作用色谱使用磷酸钠或磷酸钾缓冲液，所述磷酸钠或磷酸钾缓冲液含有50%饱和度的硫酸铵盐、浓度范围从2M到5M的氯化钠及仅浓度范围从2M到3M的硫酸钠。

10.根据权利要求6所述的方法，其中，所述离子交换色谱是一种阴离子交换色谱。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述阴离子交换色谱是在阴离子交换树脂上实施的，所述阴离子交换树脂选自由DEAE cellulose、MonoQ、Capto Q、Eshmino Q、Gigacap Q650M、Nuvia-Q、Cellufine Q-h、MiniQ、Source15Q和30Q、Q、DEAE Sepharose Fast Flow、Q Sepharose high Performance、QAE SEPHADEX^TM和FAST Q SEPHAROSE^TM(GE Healthcare)，来自Biorad的UNOsphere Q、Macro-Prep DEAE和Macro-Prep High Q，Ceramic HyperD Q、ceramic HyperD DEAE、Toyopearl SuperQ-650S、650M和650C、QAE-550C和650S、DEAE-650M组成的组。

12.根据权利要求10所述的方法，其中，根据血清型，所述阴离子交换柱在含10至60%1M NaCl的磷酸缓冲液中洗脱。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，根据血清型，所述阴离子交换柱在含10%、15%、20%、25%、30%、45%和60%1M NaCl的磷酸缓冲液中洗脱。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，根据血清型，所述阴离子交换柱在含线性梯度或不连续梯度的1M NaCl的磷酸缓冲液中洗脱。