[发明专利]一种制备多糖的新方法

说明书

背景技术

被分类为肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae，pneumococci,Pn)的病原菌，依据有机体的荚膜多糖(PnPs)被细分成84种抗原血清型。由这些有机体引起的疾病状态包括肺炎、脑膜炎、中耳炎、慢性支气管炎的菌血症和急性加重期、鼻窦炎、关节炎和结膜炎。然而，这些疾病中的多数是由已知的84种分离株中有限的亚系引起的。因此，含有这些有机体的最普遍和最致病的分离株的PnPs的多价疫苗，能提供针对这个分类中最常报道的病原菌中的很高比例的保护。

用于制备结合疫苗的PnPs通常与大量的常见杂质/污染物相结合，这些杂质/污染物称为C-多糖(C-Ps)。虽然C-多糖污染物的存在不会干扰针对类型特异性抗原的免疫应答，但是抗-C-多糖抗体的产生可能与组织破坏有关，这种组织破坏在一些未分辨的肺炎球菌感染中被观察到。C-Ps内容物能降低肺炎球菌结合疫苗的效力。

C-Ps也被WHO分类为一种多糖杂质，参考WHO TRS19-2310月，2009(保证肺炎球菌结合疫苗的质量、安全性和效力的建议，Recommendations to assure the quality,safety and efficacy of pneumococcal conjugate vaccines)。

因此，提高多糖纯度，即降低基团-特异性C-多糖的污染的需求一直存在于工业中。

美国专利4242501请求保护基于硫酸铵的多糖沉淀方法，其中C-多糖含量降低到少于0.5%。然而这种纯化方法包含12步，并且也利用酒精进行沉淀。

美国专利5623057请求保护基于使用异丙醇的PnPs纯化方法，并且在多糖部分水解(声波的或热的)之前或之后也使用离子交换色谱，使C-多糖含量少于3%。

美国专利5714354请求保护一种“无酒精”的PnPs纯化方法，使用CTAB(1-4%)、羟磷灰石色谱和离子交换色谱。此方法中CTAB步骤除去了大多数C-多糖。

美国专利5847112请求保护C-Ps降低3-20倍。然而此专利的PnPs纯化包含多个异丙醇和塞他弗伦步骤。

1572/MUM/2010请求保护一种基于脱氧胆酸盐和疏水作用色谱（即无酒精和CTAB）的纯化方法。此专利中C-Ps的含量是4-14%。

现有技术的方法使用CTAB、酒精并且是多步骤的。CTAB以前已被用来进行多糖的选择性沉淀，然而，CTAB是有害化学品。

从沉淀的PnPs中进一步除去CTAB需要乙醇。在肺炎球菌多糖纯化中，乙醇的使用与下列操作问题有关：a)乙醇的使用需要防火设施；b)设计这样的设施成本很高，c)乙醇受海关/政府的监管，d)乙醇是有害的，e)废水处理非常困难，f)需要的乙醇量巨大，每升加工材料几乎需要～4-6L乙醇，并且g)需要昂贵的炭过滤和冻干步骤。

现有技术利用乙醇和CTAB步骤的方法需要77-90hrs以完成C-Ps-降低的多糖制备，因此是耗劳动力的。

出人意料地，我们发现在制备肺炎球菌多糖时，当使用优选地单个或多个色谱步骤时，能观察到基团特异性C-Ps含量的大量减少。所述的步骤是无酒精和CTAB的，容易规模化、是有成本效率的以及劳动力节约的。

发明内容

本发明是一种无酒精和CTAB的纯化肺炎球菌多糖的方法，用于多糖疫苗的制备。本方法基于C-Ps和PnPs表面净电荷的差异，用色谱分离的方法从多糖(PnPs)中分离C-Ps。此方法是纯化肺炎球菌多糖的通用方法。

通过本方法制备的PnPs有约60至70%的回收率，其中C-多糖污染物相比于疏水作用色谱(HIC)之后或离子交换色谱(IEX)之前的C-Ps的含量降低1至5倍，蛋白质污染物少于1%，且核酸污染物少于1%。所述的方法已经在研究、中试和生产规模实现。

此方法与基于CTAB/酒精的方法相比，纯化多糖能节约80-90%的时间以及降低90%的成本。

附图说明

HIC后随离子交换色谱的图

图1HIC前的肺炎球菌多糖19F-HPLC图谱

图2疏水作用色谱(HIC)后的肺炎球菌多糖19F-HPLC图谱

图319F PnPs-HIC色谱-后的NMR

图4HIC-纯化的PnPs的离子交换色谱图

图5IEX之后的19F PnPs(最终PnPs/实施例1)的HPLC图谱

图6IEX之后的PnPs的NMR

直接离子交换色谱的图